湖南省525株非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的菌種鑒定與流行特征

李文彬，胡培磊，陳忠南，陳振華，易松林，余艷艷，郭靖瑋，劉彬彬，王巧智，萬康林，譚云洪

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)是指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)與麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌，原稱為非典型分枝桿菌(atypical mycobacteria)，其生物學(xué)特性有別于結(jié)核分枝桿菌[1-2]。非結(jié)核分枝桿菌廣泛存在于自然界的土壤、塵埃、水、魚類和家禽中，是一類條件致病菌。人類主要從環(huán)境中獲得感染，引起非結(jié)核分枝桿菌病，即人類感染NTM可引起相關(guān)組織或臟器的病變，一般患病后主要表現(xiàn)為咯血、單側(cè)無痛性淋巴結(jié)腫大、滑膜炎和骨髓炎等[3]。目前發(fā)現(xiàn)的NTM有249個(gè)菌種、17個(gè)亞種、5個(gè)變種，但是引起人類疾病的僅占少數(shù)，半個(gè)世紀(jì)前，由于結(jié)核病的肆虐，因此,人們對(duì)非結(jié)核分枝桿菌病未予以足夠的重視[4]。

近年來，由于分子生物學(xué)技術(shù)的不斷優(yōu)化，使得實(shí)驗(yàn)室對(duì)NTM診斷技術(shù)不斷提高，且人們對(duì)NTM 感染的重視以及艾滋病流行等因素，使得近年來NTM病呈快速增多趨勢(shì)，甚至可能超過結(jié)核病的發(fā)病率和患病率，現(xiàn)已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[5]。由于不同種NTM感染后的臨床癥狀和體征、感染治療方案等方面可能存在不同，臨床上多造成誤診、誤治，使得患者病程遷延[6]，因此，鑒定NTM菌種對(duì)診斷和治療有重要意義。近年來，NTM菌種鑒定技術(shù)取得了很大的進(jìn)步，為臨床提供了簡(jiǎn)單、實(shí)用以及快速的菌種鑒定技術(shù)[7]，促進(jìn)了 NTM 感染性疾病診斷和治療水平的提高。

本研究通過收集湖南省胸科醫(yī)院2019年1月1日至2020年12月31日期間住院及門診病人的痰標(biāo)本或者其它體液標(biāo)本，通過BACTEC MGIT 960系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱MGIT960)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，獲得的陽性培養(yǎng)物，對(duì)初步鑒定為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的菌株進(jìn)行菌種鑒定，并分析湖南省非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的菌種類型及其分布特征，為非結(jié)核分枝桿菌病的防治提供基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 倫理聲明 本論文涉及的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，經(jīng)過本單位醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，入選的病例均來自我院就診的患者，均獲得知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株 2019-2020年湖南省胸科醫(yī)院經(jīng)MGIT960培養(yǎng)陽性的6 515株分枝桿菌臨床分離菌株。其中男性分枝桿菌感染者為4 456例，女性2 059例。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株來源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室。

1.2.3 試劑與儀器 抗酸染色試劑、改良羅氏培養(yǎng)基、對(duì)硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；4% NaOH、pH6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)由科室自配；BACTEC MGIT 960分枝桿菌分析系統(tǒng)及其配套試劑包括MGIT試管(含7H9液體培基)、油酸-白蛋白-右旋糖-過氧化氫酶(OADC)添加劑和雜菌抑制劑購自美國(guó)BD公司；MPB64抗原檢測(cè)試劑盒購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)公司；PCR反應(yīng)試劑購自北京全式金生物技術(shù)公司，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，PCR擴(kuò)增儀購自杭州博日科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分枝桿菌分離培養(yǎng) 臨床標(biāo)本首先接種于MIGT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)儀器報(bào)陽標(biāo)本進(jìn)行抗酸染色涂片，報(bào)告“分枝桿菌培養(yǎng)陽性”。

1.3.2 MTBC與NTM初步鑒定 首先使用MPB64蛋白免疫膠體金法初步鑒定，即直接吸取100 μL MGIT 960陽性菌株液體培養(yǎng)基的上清液加入到檢測(cè)孔中，1 h內(nèi)觀察結(jié)果。檢測(cè)線和質(zhì)控線都出現(xiàn)紅色條帶即為陽性。隨后取100 μL膠體金法判定為陰性的菌液分別接種于改良羅氏培養(yǎng)基(L-J)、PNB培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)[8-9]。觀察菌落生長(zhǎng)情況。鑒定結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 MTBC與NTM初步鑒定判定標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 MTBC and NTM preliminary identification criteria

1.3.3 NTM菌種鑒定

1.3.3.1 菌株DNA提取 鑒定為NTM菌株，經(jīng)L-J固體斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后，于其上刮取1接種環(huán)菌落，置于生理鹽水中制成菌懸液。使用lab-aid 824儀器提取 DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 PCR 根據(jù)選取分枝桿菌16SrRNA和Hsp65基因片段序列，設(shè)計(jì)引物(引物信息見表2)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16SrRNA和Hsp65的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為800 bp和400 bp。

表2 NTM菌種鑒定PCR引物信息Tab.2 NTM strain identification PCR primer information

PCR總反應(yīng)體系30 μL，引物各1 μL，2×Tag PCR Master Mix 15 μL，ddH2O 12 μL，模板1 μL，陰陽性對(duì)照孔加入結(jié)核分枝桿菌陽性質(zhì)控品和結(jié)核分枝桿菌陰性質(zhì)控品。擴(kuò)增過程為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖(含GelRed 核酸染料)凝膠中電泳，觀察目的條帶是否正確。

1.3.3.3 測(cè)序及同源性比對(duì) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè) 序，利用BLAST將測(cè)序得到的基因序列與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI網(wǎng)站)數(shù)據(jù)庫作同源性比對(duì)，相似度≥97%即可確定菌種。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Excel軟件對(duì)菌種鑒定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 分枝桿菌檢出情況 2019-2020年，MGIT960培養(yǎng)系統(tǒng)報(bào)陽菌株數(shù)為6 527株，其中12株顯示有雜菌生長(zhǎng)，即共分離出6 515株分枝桿菌，其中MPB64抗原檢測(cè)陽性4 921株，陰性1 070株；MPB64抗原陰性標(biāo)本中，PNB陽性546株，陰性524株；PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)陽性的標(biāo)本中，共有525株經(jīng)16SrRNA和Hsp65測(cè)序鑒定確證為NTM。

2.2 NTM感染者人群、地區(qū)分布特征 本研究525株NTM感染者，男性285株，占比54.29%；女性240株，占比45.71%，NTM感染者男性多于女性；人群分布以農(nóng)民為主，共367株，占比69.90%；城市居民158株，占比30.10%，職業(yè)分布以退休人員36人(6.86%)、無業(yè)人員27人(5.14%)和學(xué)生22人(4.19%)居多；年齡分布以40歲以上者最多，共402株，占比76.57%；20歲以下患者33株，占比6.29%；21～39歲患者90株，占比17.14%。NTM分離率較高的地區(qū)分別為郴州市(16.57%)、湘潭市(14.84%)、湘西自治州(12.89%)、岳陽市(11.79%)、衡陽市(11.66%)，其它市區(qū)的分離情況見表3。5 445株MTBC，其中男性3 807株，占比69.93%；女性1 638株，占比30.08%；MTBC感染者，同樣以農(nóng)民為主，共3 328株，占比61.12%。除農(nóng)民外，職業(yè)分布以職員357人(6.56%)、學(xué)生351人(6.45%)、無業(yè)人員345人(6.34%)和退休人員292人(5.36%)居多。NTM和MTBC的職業(yè)分布見表4。

表3 2019-2020年湖南省不同地區(qū)NTM的分離率Tab.3 Separation rates of NTM in different regions of Hunan Province in 2019-2020

表4 NTM和MTBC患者職業(yè)分布情況Tab.4 Occupational distribution of patients with NTM and MTBC

2.3 NTM菌種鑒定結(jié)果 525株NTM均已測(cè)序鑒定確定菌種，525株NTM菌株，經(jīng)16SrRNA和Hsp65基因測(cè)序分析，鑒定為27種，分別為膿腫分枝桿菌190株(36.19%)、胞內(nèi)分枝桿菌174株(33.14%)、鳥分枝桿菌64株(12.19%)、戈登分枝桿菌47株(8.95%)、偶發(fā)分枝桿菌8株、馬賽分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌各7株、龜分枝桿菌4株、猿分枝桿菌和瘰疬分枝桿菌各3株、慢生分枝桿菌2株、其它16種少見分枝桿菌各1株。主要流行的NTM菌種有7種，見圖1。

圖1 2019-2020年湖南省主要流行的NTM菌種占比情況Fig.1 Proportions of major NTM strains circulating in Hunan Province from 2019 to 2020

2.4 NTM菌種地區(qū)分布情況 本研究去除了非湖南省戶籍的感染者檢出的14株NTM，對(duì)本研究檢出的湖南省不同地區(qū)、不同種的NTM的分離率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5所示。膿腫分枝桿菌分離較多的地區(qū)為：郴州市(9.47%，16/169)、湘西自治州(8.89%，20/225)、衡陽市(8.07%，36/446)和永州市(5.38%，26/483)；胞內(nèi)分枝桿菌分離較多的地區(qū)為：湘潭市(7.10%，11/155)、郴州市(7.10%，12/169)和岳陽市(6.46%，40/619)；鳥分枝桿菌分離較多的地區(qū)為：岳陽市(1.94%，12/619)和益陽市(1.57%，8/511)。

表5 常見NTM菌種地區(qū)分離情況Tab.5 Regional composition of common NTM strains

3 討 論

近年來，全國(guó)流行病學(xué)調(diào)查顯示NTM的檢出率持續(xù)增高，本研究2019-2020年我院NTM的檢出率為8.17%，仍處于較高水平?？赡芘c人口老齡化、免疫缺陷、環(huán)境暴露以及基因芯片、分子生物學(xué)等檢驗(yàn)技術(shù)水平提高等因素有關(guān)[11-12]。NTM 肺病多發(fā)生于原有慢性肺部疾病(如慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張癥、支氣管哮喘、COPD 和肺結(jié)核等) 的患者[13]。約1/3的艾滋病(HIV)患者可繼發(fā)NTM 病，且在艾滋病和免疫功能受損者中通常表現(xiàn)為播散性NTM 病[14-15]。

由于現(xiàn)代細(xì)菌學(xué)的快速鑒別診斷方法不斷發(fā)展，使得近年來，NTM的實(shí)驗(yàn)室檢出率不斷增加，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和免疫技術(shù)的不斷發(fā)展，NTM的鑒定技術(shù)也得到了相當(dāng)大的提高。目前，我國(guó)針對(duì)NTM的早期、快速診斷，尚無敏感且特意的標(biāo)準(zhǔn)化診斷程序[16]。PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)對(duì)MTBC和NTM 的鑒別能力較強(qiáng)，但是由于其是一種培養(yǎng)方法，所以試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，且無法鑒定到具體的種水平。絕大多數(shù)MTBC在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)分泌MPB64蛋白，因此，使用操作簡(jiǎn)單、快速的MPB64蛋白免疫膠體金法，可以初步鑒別MTBC和NTM，而少數(shù)不分泌此蛋白的MTBC的MPB64抗原檢測(cè)呈陰性[17]。本研究，采用MPB64免疫膠體金法，可以快速鑒別出大部分MTBC，隨后使用PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)可以鑒別出NTM 以及膠體金法陰性的MTBC，可以避免MPB64陰性的部分菌株被誤認(rèn)為是NTM。本研究，雖然MPB64膠體金法和PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)合，節(jié)省了MTBC和NTM初步鑒定的時(shí)間，但是會(huì)使得MTBC和NTM混合感染的菌株數(shù)據(jù)丟失，僅有2株菌被鑒定為MTBC和NTM混合感染，而且PNB實(shí)驗(yàn)也會(huì)存在假陰性，作者將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中重新對(duì)MPB64陽性和PNB陰性的菌株進(jìn)行NTM鑒定，完善相關(guān)數(shù)據(jù)。

本研究通過收集湖南省胸科醫(yī)院2019年1月1日至2020年12月31日期間住院及門診病人的痰標(biāo)本或者其它體液標(biāo)本，經(jīng)培養(yǎng)及鑒定后，其結(jié)果顯示臨床分離的NTM菌種主要為膿腫分枝桿菌(36.19%)和胞內(nèi)分枝桿菌(33.14%)。NTM在年齡、性別、職業(yè)和地域分布上存在差異，NTM分離率較高的地區(qū)分別為郴州市(16.57%)、湘潭市(14.84%)、湘西自治州(12.89%)、岳陽市(11.79%)、衡陽市(11.66%)。不同地區(qū)菌種分布不同，即膿腫分枝桿菌分離較多的地區(qū)為：郴州市(9.47%)、湘西自治州(8.89%)、衡陽市(8.07%)和永州市(5.38%)；胞內(nèi)分枝桿菌分離較多的地區(qū)為：湘潭市(7.10%)、郴州市(7.10%)和岳陽市(6.46%)；鳥分枝桿菌分離較多的地區(qū)為：岳陽市(1.94%)和益陽市(1.57%)。

本研究通過MTBC與NTM菌種鑒別，并通過流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)分析出湖南省檢出的NTM菌種主要以膿腫分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌為主，為臨床結(jié)核分枝桿菌病與非結(jié)核分枝桿菌病的明確診斷提供研究基礎(chǔ)。由于近年來NTM發(fā)病率處于不斷上升的趨勢(shì)，對(duì)于NTM 病的防治仍需要更為有效的應(yīng)對(duì)措施。因此，急需研發(fā)快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的NTM檢測(cè)新技術(shù)，并依據(jù)菌種鑒定和藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果制定臨床治療方案，為廣大患者縮短N(yùn)TM病的確診時(shí)間，可以早發(fā)現(xiàn)、早治療，減輕患者痛苦、有效縮短病程。本院作為湖南省的結(jié)核病防治定點(diǎn)?？漆t(yī)院，具有來自全省14個(gè)地級(jí)市的大樣本，且初步總結(jié)了近一年內(nèi)NTM的檢出率、易感人群以及近一年的NTM菌種分布特征，與文獻(xiàn)報(bào)道的2012年1月至2017年NTM的檢出率(8.04%)、人群和菌種分布特征相吻合[18]。因此,本研究可為了解湖南省NTM的感染現(xiàn)狀提供一定的參考依據(jù)。

利益沖突：無

引用本文格式：李文彬，胡培磊，陳忠南，等. 湖南省525株非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的菌種鑒定與流行特征[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(5)：417-422. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.050