馬達(dá)里亞加病毒TaqMan RT-PCR檢測(cè)方法的建立

殷啟凱,劉文婧,王國(guó)瑋,張維嘉,付士紅,韓 坤,許崇曉,許松濤,李 樊,劉亞寧,何 英, 王振海, 聶 凱, 王環(huán)宇

馬達(dá)里亞加病毒(Madariaga virus, MADV)屬于披膜病毒科，甲病毒屬，過去被認(rèn)為是東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis virus, EEEV)的南美洲分支，又稱南美東方馬腦炎病毒[1]。東方馬腦炎病毒最開始分為4個(gè)亞型(Ⅰ～Ⅳ)，Ⅰ型常見于美洲北部，被稱為North America(NA)型，Ⅱ-Ⅳ型主要分布于美洲南部和中部，被稱為South America(SA)型[2]，由于兩者在基因組、生態(tài)學(xué)和致病機(jī)制上具有顯著差異，后直接將SA型單獨(dú)定義為MADV[3]，2020年ICTV將其分類為一個(gè)獨(dú)立的病毒。MADV為直徑70 nm左右、表面有纖突的球形包膜病毒，基因組大小約11.7 kb，為單股正鏈RNA病毒[4]。目前認(rèn)為MADV的傳播媒介主要是庫(kù)蚊，而且 MADV感染與寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、登革病毒(Dengue virus, DENV)具有相似的臨床表現(xiàn)，往往造成嚴(yán)重的后遺癥[2]。近年來，MADV在巴西[5]、海地[2]、巴拿馬[6]等拉丁美洲國(guó)家時(shí)常暴發(fā)，雖然我國(guó)目前尚未發(fā)現(xiàn)MADV的感染與傳播，但隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的推進(jìn)和國(guó)家“一帶一路”重大戰(zhàn)略的實(shí)施，國(guó)外媒介傳播病原體傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)日益增高，建立相應(yīng)的高效快速檢測(cè)方法日趨迫切。本研究基于TaqMan RT-PCR技術(shù)針對(duì)MADV建立了早期、快速檢測(cè)方法，為MADV的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)及相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)室支持。

1 材料與方法

1.1 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成 從GenBank中下載MADV的全部序列，通過Clustal X進(jìn)行多序列比對(duì)分析，使用Primer Express(ABI公司，Ver：3.0)選擇MADV保守性較高的NSP1區(qū)段，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則[7]設(shè)計(jì)特異性引物及TaqMan探針，引物和探針由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 MADV RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備 根據(jù)多序列比對(duì)分析的結(jié)果，選擇將MADV NSP1基因的保守區(qū)(134～208 bp，GI:MH359233.1)克隆至pUC57-Amp載體獲得pUC57-MADV質(zhì)粒(蘇州泓迅生物科技股份有限公司)。以線性化的pUC57-MADV質(zhì)粒為模板進(jìn)行RNA體外轉(zhuǎn)錄(Promega公司，RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7)，RNA產(chǎn)物通過熒光染料法進(jìn)行濃度定量(Invitrogen公司，QubitTMRNA BR Assay Kit)，根據(jù)公式計(jì)算拷貝數(shù)：?jiǎn)挝惑w積RNA拷貝數(shù)(copy/mL)=6.02×1023×RNA濃度(g/mL)/(RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物堿基數(shù)×340)，獲得RNA標(biāo)準(zhǔn)品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 TaqMan RT-PCR檢測(cè)體系的建立 建立MADV實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法的反應(yīng)體積為20 μL，其反應(yīng)體系包括：4×TaqPathTM1-Step Multiplex Master Mix 5μL，(ABI公司，TaqPathTM1-Step Multiplex Master Mix No ROX)，10 μmol/L 的上、下游引物與5 μmol/L 的探針各1 μL，RNA 模板2 μL，無核酸酶水10 μL。配制好的反應(yīng)體系在CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)進(jìn)行擴(kuò)增，采集FAM通道熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)試劑盒說明書設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)條件為：25 ℃ 2 min；53 ℃ 10 min；95 ℃ 2 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.4 特異性評(píng)估 用披膜病毒科甲病毒屬蓋塔病毒、辛德畢斯病毒，黃病毒科黃病毒屬西尼羅病毒、乙型腦炎病毒、寨卡病毒、登革病毒、黃熱病毒，布尼亞病毒目Tahyna病毒，呼腸孤病毒科東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬Kadipiro病毒等4科9種蟲媒病毒(病毒毒株均來源于本實(shí)驗(yàn)室保存)的RNA與MADV的RNA標(biāo)準(zhǔn)品按照建立的檢測(cè)體系同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，評(píng)估該方法的特異性。

1.5 靈敏度評(píng)估 將MADV 的RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇8個(gè)不同濃度(101～108拷貝/反應(yīng))的RNA作為模板進(jìn)行反應(yīng)確定該檢測(cè)方法的靈敏度。使用CFX Manager(Bio-Rad 公司，Ver：3.0)軟件，根據(jù)各樣品的RNA拷貝數(shù)(X軸)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)Ct值(Y軸)進(jìn)行計(jì)算分析，繪制靈敏度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 重復(fù)性評(píng)估 以8個(gè)不同濃度(101～108拷貝/反應(yīng))的RNA樣品為模板，每個(gè)濃度進(jìn)行3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算每個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)差(S)與變異系數(shù)(CV)，以評(píng)價(jià)該檢測(cè)體系的穩(wěn)定性。

1.7 不明原因發(fā)熱病例及蚊蟲樣本篩查 用建立的TaqMan RT-PCR 檢測(cè)體系和反應(yīng)條件篩查2019-2020年寧夏回族自治區(qū)、浙江省和云南省的共計(jì)81份不明原因腦炎病例急性期血清標(biāo)本及161批庫(kù)蚊標(biāo)本(血清和蚊蟲標(biāo)本均由各省疾控中心經(jīng)干冰運(yùn)輸至本實(shí)驗(yàn)室)，用MADV RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照，DENV和ZIKV的RNA作為陰性對(duì)照，無核酸酶水作為空白對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 MADV引物、探針和RNA標(biāo)準(zhǔn)品 GenBank中共有41條MADV序列，根據(jù)32條全基因組序列比對(duì)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)合成MADV NSP1基因特異性引物與探針，其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為75 bp(表1)。經(jīng)公式換算，RNA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為 1.65×1014copy/mL。

表1 TaqMan RT-PCR檢測(cè)MADV的引物與探針序列信息Tab.1 Information on primer and probe sequences for TaqMan RT-PCR for MADV detection

2.2 檢測(cè)體系特異性 利用建立的TaqMan RT-PCR方法將4科9種蟲媒病毒的RNA與MADV的RNA同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，僅MADV的RNA得到成功擴(kuò)增，其它毒株RNA均無擴(kuò)增(圖1)。

注：1.MADV，2.蓋塔病毒，3.辛德畢斯病毒，4. 西尼羅病毒，5. 乙型腦炎病毒，6. 寨卡病毒，7. 登革病毒，8. 黃熱病毒，9. Tahyna病毒，10. Kadipiro病毒，11.空白對(duì)照。圖1 MADV檢測(cè)體系特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 Evaluation of the specificity of the TaqMan RT-PCR assay for MADV

2.3 檢測(cè)體系靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線 將8個(gè)不同濃度(101～108拷貝/反應(yīng))的MADV RNA利用所建方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)限為1.0×102拷貝/反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)CFX Manager軟件分析，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.925 4X+41.208,R2=0.999 5(圖2)。

圖2 MADV病毒基因拷貝數(shù)定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of the MADV TaqMan RT-PCR assay based on the genomic copy number

2.4 檢測(cè)體系穩(wěn)定性 8個(gè)不同濃度(101～108拷貝/反應(yīng))的MADV RNA各進(jìn)行3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各稀釋度的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差S均<0.5，變異系數(shù)CV值均<1.5%(表2)。

表2 MADV檢測(cè)體系重復(fù)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.2 Stability testing of real-time PCR for MADV detection

2.5 不明原因發(fā)熱病例血清及蚊蟲樣本篩查 將2019-2020年寧夏回族自治區(qū)、浙江省和云南省的共計(jì)81份不明原因腦炎病例急性期血清標(biāo)本(乙腦病毒IgM抗體檢測(cè)為陰性)及161批庫(kù)蚊標(biāo)本提取RNA 后，利用建立的MADV TaqMan RT-PCR檢測(cè)體系和反應(yīng)條件檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

3 討 論

本研究建立的MADV TaqMan RT-PCR檢測(cè)方法，選用基因序列中較為保守的區(qū)域作為擴(kuò)增目標(biāo)片段，最低檢測(cè)限達(dá)到1.0×102拷貝/反應(yīng)，變異系數(shù)(CV)均<1.5%，表明該檢測(cè)體系具有良好的敏感性和穩(wěn)定性，用MADV的RNA與多種蟲媒病毒同時(shí)平行檢測(cè)無交叉反應(yīng)，證明該檢測(cè)方法具有較高的特異性。用本研究所建立的方法篩查2019-2020年夏季在寧夏、浙江和云南3省的81份不明原因腦炎病例的急性期血清標(biāo)本及161批庫(kù)蚊標(biāo)本，結(jié)果均為陰性，表明我國(guó)以上3個(gè)省近兩年的蚊蟲標(biāo)本和不明原因急性腦炎急性期血清標(biāo)本目前尚無MADV檢出。

MADV作為在拉丁美洲流行的病原體，通過貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)MADV最早可追溯到346年前，而且該病毒很可能起源于巴西[8]，主要能引起馬腦炎，2019年在巴西東北部Ceará州報(bào)道了由MADV引起的馬腦炎暴發(fā)[5]，馬在感染MADV后會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、極度虛弱、步伐不穩(wěn)、肌肉抽搐等癥狀，甚至死亡[9]。此前，在美洲中部和南部從未發(fā)現(xiàn)人類感染MADV[10]，但2010年在巴拿馬首次確診了13位病人是MADV陽性，而且報(bào)道的病人主要是兒童，表明MADV具有致病性[6]。另外2016年，委內(nèi)瑞拉在進(jìn)行ZIKV篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)一位12歲的小女孩癥狀與ZIKV感染十分吻合，但檢測(cè)結(jié)果為ZIKV陰性，平行檢測(cè)基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)和DENV等結(jié)果均為陰性，最后經(jīng)病毒基因序列測(cè)定后鑒定為MADV感染[11]。人感染MADV后的主要癥狀表現(xiàn)與其它蟲媒病毒感染類似，與登革熱表征尤其相似[9]，患者會(huì)出現(xiàn)突然發(fā)熱，體溫可達(dá)(39～40 ℃)，還會(huì)出現(xiàn)頭暈、惡心、乏力等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)產(chǎn)生輕度偏癱，后遺癥嚴(yán)重，人群隱性感染率在2%～5%[12]。目前認(rèn)為MADV的傳播媒介主要是庫(kù)蚊[13]，拉丁美洲的偏遠(yuǎn)地區(qū)的鼠和蝙蝠可能作為貯存宿主，但目前對(duì)于其傳播的模式仍不清楚。綜上所述，MADV能夠引起人類疾病，而且臨床癥狀與其它蟲媒病毒難以區(qū)分，此外，根據(jù)委內(nèi)瑞拉[10]、海地[2]和巴西[14]等地對(duì)人類急性發(fā)熱病例中檢測(cè)MADV的報(bào)道，MADV近年來在拉丁美洲流行不斷，因此，建立快速、靈敏且特異的檢測(cè)方法十分必要。

TaqMan RT-PCR技術(shù)是當(dāng)今應(yīng)用最為廣泛的分子診斷方法之一，具有更高的敏感性、特異性和可重復(fù)性[15]，雖然我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)MADV感染的病例，但隨著近年來國(guó)際交流日益密切，病原體的跨國(guó)傳播風(fēng)險(xiǎn)日益升高。由于缺乏特異性試劑盒，MADV的血清學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)用較少。目前發(fā)表的RT-PCR[10]、巢式RT-PCR[13,16]等分子生物學(xué)檢測(cè)方法均需結(jié)合一代測(cè)序才能完成鑒定。相關(guān)方法總實(shí)驗(yàn)步驟多、檢測(cè)用時(shí)較長(zhǎng)，而本研究建立的MADV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法上機(jī)反應(yīng)時(shí)間小于1.5 h，縮短檢測(cè)用時(shí)，提升實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)效性。本方法不僅可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的早期檢測(cè)，還將為今后開展MADV監(jiān)測(cè)及研究工作提供良好的技術(shù)支持。

利益沖突：無

引用本文格式：殷啟凱,劉文婧,王國(guó)瑋，等. 馬達(dá)里亞加病毒TaqMan RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(5)：428-432. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.057