超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸的不確定度評定

◎ 楊麗英，吳 燕，李曉頎，楊世波，張滿常

（云南省保山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，云南 保山 678000）

豆芽屬于無季節(jié)性食品，價格便宜且含有多種營養(yǎng)成分，深受廣大消費(fèi)者喜愛[1]。在生產(chǎn)中，為提高豆芽產(chǎn)量常使用4-氯苯氧乙酸，4-氯苯氧乙酸常被用作植物生長調(diào)節(jié)劑，具有增快生長速度、促進(jìn)植物成熟的作用[2-4]。但有研究表明，4-氯苯氧乙酸對小鼠的肝臟、腎臟以及成熟精細(xì)胞具有毒性作用，因此相關(guān)法律規(guī)定豆芽制作及銷售過程中禁止使用4-氯苯氧乙酸[5-6]。但目前4-氯苯氧乙酸的檢出率仍然很高，所以對它的測定及其結(jié)果的準(zhǔn)確性研究是必要的[7-8]。不確定度的數(shù)值是反映測量結(jié)果的精確度的指標(biāo)，值越小表明測量結(jié)果與真實(shí)值越接近，結(jié)果越精確。在食品檢測領(lǐng)域，不確定度的評定既能提高分析檢測質(zhì)量，又能達(dá)到檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高的目的。本文根據(jù)《測定不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[9]，結(jié)合《豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定》（BJS 201703）[10]對豆芽中4-氯苯氧乙酸的不確定度進(jìn)行評定，以期為檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters XEVOTQ-S MICRO超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國沃特世公司）；梅特勒MS205DU萬分之一精密天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；NV-15G氮?dú)獯蹈蓛x（天津博納艾杰爾科技有限公司）；渦旋混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

4-氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，批號：AL171216-10，純度＞98%；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）：粒徑范圍為40～60 μm；無水硫酸鎂；無水乙酸鈉。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取4-氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品13.94 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為139.4 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，移取該儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為13.94 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間1號溶液。移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為1.394 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間2號溶液。分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1.394 μg·mL-1）10 μL、20 μL、30 μL、40 μL 和 50 μL及 標(biāo) 準(zhǔn) 中 間 液（13.94 μg·mL-1）10 μL、20 μL， 用空白基質(zhì)提取液定容至1.0 mL，得到基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品的前處理

1.3.1 樣品溶液的提取

稱取充分混勻的試樣10.0 g（精確至0.001 g）于50 mL具塞離心管中，加入0.1%甲酸酸化的乙腈溶液20 mL，旋渦混勻2 min，再加入4 g無水硫酸鎂和1 g無水乙酸鈉，立即渦旋混合1 min，以10 000 r·min-1離心5 min使乙腈和水相分離，吸取全部上清液至50 mL容量瓶，樣品殘渣再次加入0.1%甲酸的乙腈溶液20 mL重復(fù)上述操作，合并上清液于上一個容量瓶中并用0.1%甲酸的乙腈定容至刻度。

1.3.2 樣品溶液的凈化

精密移取上清液4 mL置于裝有300 mg無水硫酸鎂和100 mg C18的QuEChERS離心管中，旋渦混合2 min，以10 000 r·min-1離心5 min，移取全部上清液于10 mL離心管中，氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，渦旋混勻1 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：甲醇，0.1%甲酸水40∶60（體積比）；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1.0 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI源），正離子掃描模式（ESI+），采用多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描（Multiple Reaction Monitoring，MRM），離子源溫度為150 ℃、毛細(xì)管電壓為2.0 kV，碰撞能量及定性定量離子質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 4-氯苯氧乙酸質(zhì)譜參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的來源分析

從測量過程和被測量的數(shù)學(xué)模型分析，各相關(guān)不確定如圖1所示。

圖1 不確定度分量的來源圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

2.2.1 原始標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來源Stanford Analytical Chemicals Inc.、純度98%及擴(kuò)展不確定度0.5%，按正態(tài)分布考慮，k=2，確定為B類評定，得到標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的值為：

2.2.2 稱量引入的不確定度

4-氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品稱取質(zhì)量為0.010 00 g，使用分度值為0.01 mg的分析天平，擴(kuò)展不確定度為0.15 mg，k=2，為B類評定。得到標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的值為：

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制步驟中量具校準(zhǔn)引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制步驟中使用的玻璃量具，參照《常用玻璃量具檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）的要求，有對應(yīng)的最大允差，按矩形分布考慮為B類評定，由此計算各量具的不確定度分量（表2）。

由表2中數(shù)據(jù)合成的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制步驟中玻璃量具引入的不確定度為：

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制步驟中量具校準(zhǔn)引入的不確定度表

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制步驟中溫度波動引入的不確定度

玻璃量具的校正溫度一般為T校正=20 ℃，而實(shí)驗(yàn)在（23±0.5）℃下完成，此溫度下產(chǎn)生的不確定度可根據(jù)估算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來計算，溶劑以甲醇為代表，甲醇的膨脹系數(shù)為1.2×10-3℃-1，玻璃的膨脹系數(shù)為9.75×10-6℃-1(可忽略不計)。按矩形分布考慮，其結(jié)果如表3所示。

由表3中數(shù)據(jù)合成的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制步驟中溫度波動引入的不確定度為：

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制步驟中溫度波動引入的不確定度表

綜上，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制的合成不確定度為：

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

4-氯苯氧乙酸濃度X是工作曲線回歸計算得出，由實(shí)驗(yàn)計算得出，回歸方程Y=mX+b（Y為色譜峰峰面積，X為4-氯苯氧乙酸濃度，μg·mL-1），本次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為Y=113 956X-570.61，R2=0.999 1。具體數(shù)據(jù)結(jié)果見表4。S與SXx的計算結(jié)果如下：

表4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相關(guān)系數(shù)表

則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度為：

式中：S=240.31；SXx=0.051 5；m為斜率，m=113 956；b為截距，b=-570.61；p為樣品測量次數(shù)，p=2；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)測量總次數(shù)，n=14；x為各標(biāo)準(zhǔn)溶液中4- 氯苯氧乙酸濃度的平均值，x=0.089 61 μg·mL-1；X為樣品測定溶液中4-氯苯氧乙酸濃度平均值，X=0.019 32 μg·mL-1；Xi為濃度值，μg·mL-1；Yi為色譜峰峰面積。

2.4 樣品制備過程引入的不確定度

2.4.1 樣品稱量引入的不確定度

稱量試樣豆芽10.193 8 g、10.141 7 g，使用分度值為0.01 g的分析天平，擴(kuò)展不確定度為0.03 g，k=2，確定為B類評定。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4.2 樣品提取、凈化引入的不確定度

樣品制備過程中使用的玻璃量具，參照《常用玻璃量具檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）的要求，有對應(yīng)的最大允差，按照矩形分布考慮，由此估算各量具的不確定度分量（表5）。

由表5中數(shù)據(jù)合成的樣品制備過程量具引入的不確定度為：

表5 樣品制備過程中玻璃量具引入的不確定度表

因此，樣品處理引入的合成不確定度為：

2.5 回收率引入的不確定度

考察回收率是對樣品前處理過程引入的不確定度最有效的評定方法之一。因此，對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，并對加標(biāo)的樣品進(jìn)行測定，兩次平行回收率分別為99.34%、97.07%，平均回收率為98.20%。

參照公式：重復(fù)性+證書標(biāo)準(zhǔn)值，回收率的不確定度公式為：

式中：urel(Rc)為回收率的不確定度；為回收率的平均值，%；s(R)為回收率的標(biāo)準(zhǔn)差；n為回收率的個數(shù)；u(Xs)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度來源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書；Xs為標(biāo)準(zhǔn)值濃度來源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書。

2.6 樣品重復(fù)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定

同一操作人員在相同條件下對同一標(biāo)樣進(jìn)行6次測定，4-氯苯氧乙酸的峰面積分別為6 929.527、6 977.877、6 942.843、6 938.554、6 951.440 和6 996.335，為A類評定，計算公式為：

2.7 標(biāo)準(zhǔn)不確定度報告及結(jié)果表示

2.7.1 相對標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度來源及分量見表6。相對標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度為：

表6 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表

2.7.2 擴(kuò)展不確定度

查閱《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[9]的相關(guān)規(guī)定，按95%的置信概率，包含因子k=2，則4-氯苯氧乙酸含量的擴(kuò)展不確定度為

2.7.3 不確定度報告

試樣中4-氯苯氧乙酸的含量為23.7 mg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)要求保留3位有效數(shù)字，所以豆芽中4-氯苯氧乙酸含量不確定度為（23.7±0.805 8）mg·kg-1，包含因子k=2。

3 結(jié)論

本研究采用了液質(zhì)聯(lián)用法測定豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑4-氯苯氧乙酸的不確定度評定，分析結(jié)果顯示回收率的測定對不確定度的影響最大，因此在日常檢測過程中可通過增加樣品加標(biāo)重復(fù)性測定等措施，以降低檢測結(jié)果的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定對不確定度的影響次之，在今后的檢驗(yàn)工作，要控制實(shí)驗(yàn)室檢測環(huán)境溫度，盡量使用精度較高的稱量工具及準(zhǔn)確度等級較高的標(biāo)準(zhǔn)品和器皿來配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。