氣-質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定食品中N-二甲基亞硝胺方法的改進(jìn)

◎ 謝亞興

（江西嘉信檢測(cè)有限公司，江西 南昌 330000）

肉制品、水產(chǎn)品在加工或腌制過(guò)程中，常加入硝酸鹽和亞硝酸鹽作為防腐劑和護(hù)色劑，而在腌制或加熱后，易發(fā)生胺反應(yīng)，生成亞硝胺類致癌物，其中N-二甲基亞硝胺為常見(jiàn)的強(qiáng)致癌物質(zhì)[1]。有研究表明，二甲基亞硝胺在腌制的肉制品中檢出率很高，是人們安全飲食要關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題[2-4]。

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）[5]中規(guī)定了食品中N-二甲基亞硝胺的限量：肉及肉制品≤3.0 μg·kg-1，水產(chǎn)品及制品≤4.0 μg·kg-1。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中N-亞硝胺類化合物的測(cè)定》（GB 5009.26—2016）[6]中氣相色譜-熱能分析法中所用的熱能分析器（Thermo-Energy Analyzer，TEA），在食品檢測(cè)領(lǐng)域適用該儀器檢測(cè)項(xiàng)目較少，且價(jià)格昂貴，不宜推廣；而氣-質(zhì)聯(lián)用法具有前處理復(fù)雜、取樣量大、耗時(shí)長(zhǎng)、試劑用量大、無(wú)法批量化處理以及效率低等缺點(diǎn)[7]。

本研究運(yùn)用QuEChERS前處理，利用基質(zhì)分散萃取機(jī)理，能簡(jiǎn)單有效、快速穩(wěn)定的達(dá)到吸附干擾物、保留目標(biāo)物與凈化樣品的目的[8-9]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2020 NX氣質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津；RGL-200T高速冷凍離心機(jī)，盧湘儀公司；MTV-100型渦旋混合器和PS-100A型超聲提取機(jī)，東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司；FYL-Y5-100L型恒溫冰箱，思錦科技。

1.2 材料與試劑

N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg·mL-1），壇墨；乙腈、丙酮、乙酸乙酯及二氯甲烷均為色譜純，sccbayer；乙二胺-N-丙基硅烷（Primary Secondary Amine，PSA）、C18填料及石墨化碳黑（GCB）均為填料級(jí)，天津賽飛樂(lè)生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂，均分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：SH-Rtx-Wax（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度230 ℃，檢測(cè)器溫度240 ℃，不分流進(jìn)樣。升溫程序：40 ℃保持3 min；以10 ℃·min-1的速率升溫至110 ℃；再以40 ℃·min-1的速率升溫至240 ℃，保持 5 min。進(jìn)樣量 1.0 μL，柱流量 1.5 mL·min-1。

1.3.2 質(zhì)譜條件

選擇離子監(jiān)測(cè)模式，定量離子74，定性離子42、43、44和74，離子源：EI源，電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度230 ℃。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確吸移標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用二氯甲烷逐級(jí)稀釋，配制成濃度為 0.01 μg·mL-1、0.02 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1和 0.20 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣分析。

1.3.4 樣品前處理

稱取10 g試樣于50 mL離心管中，加10 mL飽和NaCl水溶液、20 mL提取試劑，渦旋振蕩30 min，超聲30 min，-18 ℃下冷凍3 h，4 ℃下以 6 000 r·min-1離心5 min，取3 mL上清液于10 mL離心管，加入QuEChERS填料，渦旋2 min，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液，過(guò)0.22 μm的濾膜后，供氣-質(zhì)聯(lián)用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）分析測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

按1.3.4前處理，對(duì)丙酮、乙酸乙酯、乙腈和二氯甲烷4種試劑提取效果進(jìn)行研究。如圖1，丙酮和乙酸乙酯的提取效果較差，乙腈和二氯甲烷的提取效果相對(duì)較好。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品含油脂較多時(shí)，若用二氯甲烷，會(huì)帶入較多油脂，凈化困難。而用乙腈，回收效果好，蛋白質(zhì)和油脂等雜質(zhì)少。綜上，選用乙腈作為提取溶劑。

圖1 不同溶劑對(duì)N-二甲基亞硝胺的回收情況圖

2.2 冷凍時(shí)間的優(yōu)化

提取溶劑為乙腈，按1.3.4前處理，研究不同冷凍時(shí)間的影響。如圖2，當(dāng)冷凍時(shí)間在1～4 h時(shí)，回收率較好，4 h后回收率逐漸下滑。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在1～2 h時(shí)，因時(shí)間較短，部分油脂和蛋白質(zhì)無(wú)法完成凝固，除雜效果差；當(dāng)不短于3 h時(shí)，除雜效果較好，而時(shí)間為3 h時(shí)，回收率也較好，因此本試驗(yàn)選擇冷凍時(shí)間為3 h。

圖2 不同冷凍時(shí)間對(duì)N-二甲基亞硝胺回收率影響圖

2.3 凈化填料的優(yōu)化

分別對(duì)a：100 mg GCB；b：200 mg PSA填料；c：200 mg C18填料；d：100 mg C18+100 mg PSA；e：100 mg GCB+100 mg C18；f：100 mg GCB+100 mg PSA；g：QuEChERS填料（100 mg C18+100 mg PSA+50 mg GCB+200 mg無(wú)水硫酸鎂）的凈化效果及回收進(jìn)行研究。由圖3可得，填料a～f的回收效果相差不大，而QuEChERS填料回收效果最佳，因此選擇QuEChERS填料為凈化填料。

圖3 不同凈化填料對(duì)N-二甲基亞硝胺回收率的影響圖

2.4 線性關(guān)系及方法檢測(cè)限

將1.3.3配制的溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5，說(shuō)明N-二甲基亞硝胺在0.01～0.20 μg·mL-1呈現(xiàn)較好的線性。以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)的3倍信噪比作為N-二甲基亞硝胺在儀器上的檢出限，儀器的檢出限為0.075 4 ng·mL-1，方法的檢出限為 0.15 μg·kg-1＜標(biāo)準(zhǔn)檢出限（0.3 μg·kg-1），說(shuō)明檢出限能滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.5 方法加標(biāo)回收試驗(yàn)及精密度

以牛肉、肉松、大黃魚和魷魚干4種陰性樣品為基質(zhì)，分別添加 0.2 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1的N-二甲基亞硝胺，按上述優(yōu)化后的前處理步驟處理樣品，每個(gè)樣品平行測(cè)定6次。計(jì)算6次平行試驗(yàn)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。如表1所示，加標(biāo)回收率為83.8%～101.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～5.3%，說(shuō)明本方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

表1 加標(biāo)回收率及精密度結(jié)果表（n=6）

3 結(jié)論

本文采用QuEChERS前處理技術(shù)，對(duì)食品中N-二甲基亞硝胺的前處理進(jìn)行優(yōu)化研究。結(jié)果表明，以乙腈作為提取溶劑，在-18 ℃下冷凍3 h，QuEChERS凈化填料選用100 mg C18+100 mg PSA+50 mg GCB+200 mg無(wú)水硫酸鎂時(shí)可得到最佳試驗(yàn)結(jié)果。本試驗(yàn)條件下，加標(biāo)回收率為83.8%～101.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～5.3%，方法檢測(cè)限為0.15 μg·kg-1，滿足標(biāo)準(zhǔn)的要求。本法操作簡(jiǎn)單方便，可批量操作，適用于食品中N-二甲基亞硝胺含量的測(cè)定。