普洱茶貯藏過程中含水量與多酚變化的相關性分析

◎ 單治國，張春花，滿紅平，李國鑫，陳小強

（1.普洱學院，云南 普洱 665000；2.普洱市質量技術監(jiān)督綜合檢測中心，云南 普洱 665000）

普洱茶在我國具有極為悠久的發(fā)展歷史，有關其貯藏工藝的論述最早可追溯至唐宋時期。當前伴隨茶葉市場規(guī)模的成型、擴大，普洱茶中蘊藏的巨大經濟、社會價值逐漸凸顯出來，越來越多研究者將目光聚焦于此，從普洱茶成分、功效等角度展開論述，對貯藏環(huán)節(jié)的研究主要集中在環(huán)境條件，以及渥堆、翻堆等操作上。部分文獻中還就普洱茶主要成分變化情況展開了研究，成果顯示，伴隨貯藏時間推移，普洱茶中茶多酚、兒茶素總量會出現較為明顯的下降，從而緩解茶葉苦澀特性，增強醇厚、回甘之感[1-2]。但整體來看，已有文獻中并未明確各要素及成分變化的相關性特征，有待補充和完善，本文聚焦于此，就含水量、多酚變化的相關關系、影響機理等進行深入探究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大葉種曬青毛茶；色譜純乙腈、乙酸；70%甲醇水溶液；10%福林酚試劑等。

分析天平，精度為0.001 g；離心機，轉速為3 500 r·min-1；液相色譜儀；分光光度計等。

1.2 試驗方法

含水量是普洱茶貯藏過程中關鍵的影響因素，直接關系著茶葉本身的品質轉化進程。本次試驗采用了同樣地區(qū)、同批次的大葉種曬青毛茶，將樣本平均分為2組并進行加水增濕操作，其中A組樣本原含水量為11.44%，B組樣本初始含水量為9.21%，經過加水處理后，每組分出7個小樣本，分別增加0.5%、10.0%、15.0、20.0%、25.0%和30.0%的含水量，并命名為A0、A5、A10、A15、A20、A25和A30，以及B組的B0、A5、B10、B15、B20、B25和B30。處理完成后置于實驗室專用貯藏柜中，貯藏平均溫度為15.0 ℃，平均濕度為65%。整個貯藏周期為60 d，經過30 d、45 d以及60 d后，對茶樣中多酚、水分、茶色素等展開測定[3]。

1.2.1 含水量測定方法

為確保普洱茶茶樣增濕達到設計標準，在操作完成后，還應進行必要的含水量測定，從茶堆表面、內芯分別取5 g樣本，將之置于指定烘干器皿中，注意器皿必須經過干燥箱1 h的預處理，冷卻至室溫后稱重，數值精確到0.001 g。隨后試樣連同器皿一同送入120℃干燥箱，皿蓋應當打開斜靠在旁邊，加熱時長為1 h，取出后放置在干燥箱內，等待其冷卻至室溫并稱重、記錄，計算公式為水分含量=（m1-m2/m0）×100%，其中m1表示試樣與烘皿烘干前質量，m2表示試樣與烘皿烘干后質量，m0則表示試樣質量。

1.2.2 茶多酚及兒茶素測定方法

兒茶素測定主要采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）， 用 于測定的茶樣應當處于磨碎狀態(tài)，接著稱取0.2 g置于離心管中，加入經過預熱的70%甲醇水溶液，摻量控制在5 mL即可，充分攪拌后送入水浴，維持時間為10 min，過程中注意觀察、攪拌，完成后冷卻至室溫送入離心機，離心時間同樣為10 min。上清液放置于容量瓶儲存，殘渣則重復上述操作進行二次提取，完成后與原上清液合并，定容至10 mL并搖勻，過濾后儲存待用，后續(xù)所有測定操作應當控制在24 h以內，以防母液失效。測試環(huán)節(jié)取2 mL母液，將其轉移至10 mL容量瓶，并定容搖勻、過濾，最后采用高效液相色譜儀完成最終含量測定[4]。

茶多酚母液的制備與兒茶素步驟基本相同，測定環(huán)節(jié)需要取1.0 mL母液置于容量瓶之中，定容搖勻，再吸取1.0 mL放置于試管內部等待測定操作，接著取同等量的沒食子酸工作液、清水，同樣放置在試管內部，分別加入適量福林酚試劑，等待3～8 min充分反應之后，加入適量的碳酸氫鈉溶液，定容搖勻。將幾組試劑放置在室溫條件下，等待60 min后，即可借助分光光度計開展吸光度測定。

1.2.3 茶色素測定方法

考慮到茶多酚在貯藏過程中會發(fā)生氧化反應，并進一步生成茶紅素、茶黃素等物質，因此有必要對其含量情況進行測定，以明確含水量對茶多酚總量的影響機理，弄清楚茶多酚損失去向。茶色素測定環(huán)節(jié)，首先取3 g茶樣，將其放置于250 mL錐形瓶中，并加入適量沸水進行水浴提取，提取時間持續(xù)10 min，完成后及時用脫脂棉進行過濾。待到茶湯冷卻至室溫后，取30 mL置于分液漏斗中，加入適量乙酸乙酯，按照標準振蕩5 min促進分層，分層后的液體要分開盛放。接著吸取2 mL乙酸乙酯層置于容量瓶中，加95%乙醇定容，定容后液體總量為25 mL，搖勻并移至試管中，測定時以95%乙醇作參照，采用分光光度計進行輔助測定。

2 結果與分析

2.1 茶多酚總量變化

茶多酚是決定普洱茶茶湯品質的關鍵要素，通常又被稱作“茶單寧”，是兒茶素、黃酮等眾多化合物的集成，其口感較澀同時收斂性強，是普洱茶苦澀、回甘的主要源頭。多酚在茶葉干重中占比適中，基本上維持在15%～30%，當干茶被制成茶湯后，其在水浸出物中占比會進一步提升，最高可達60%～75%，對茶湯滋味、湯色均有較大的貢獻率。

經過試驗后發(fā)現，伴隨時間推移，A、B兩組的茶多酚含量總體呈下降趨勢，而水量增加對B茶樣多酚含量影響并不明顯，各處理之間的對比并不明顯，含量最終維持在10%左右；A組試驗中部分茶樣的含水量增重率達到15%，同時多酚含量變化幅度減小，最終保持在6%左右（變化情況可見圖1、圖2）。說明初始含水量越高的樣本中，茶多酚流失速度越快，最終含量越少，這種狀況可能是由于含水量越高的茶堆中，濕熱作用越明顯，茶多酚轉換也就越發(fā)頻繁，因此含水量、茶多酚整體上呈現出一種反相關關系，試驗中當含水量達到26%以上時，茶多酚含量最低。

圖1 A組茶多酚含量變化圖

圖2 B組茶多酚含量變化圖

2.2 兒茶素類物質含量變化

兒茶素是多酚主要成分，總體占比高達70%～80%，在影響茶葉品質滋味的同時，還具備極好的抗氧化能力，可被用于抗腫瘤、抗誘變等藥物的研發(fā)。其單體構成較為復雜，從當前研究成果來看，確定茶葉中存在的兒茶素高達12種，L-EC（表兒茶素）、L-GC（沒食子兒茶素）和L-ECG（表兒茶素沒食子酸酯）等均是較為常見的類型，其中尤以L-EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）總量最多，可占到兒茶素的50%左右。本文綜合普洱茶生產現狀，主要選取5種物質進行含量測定，探究其與含水量之間的相關關系[5]。

首先是兒茶素總體變化情況，A、B兩組下降趨勢均十分明顯，降幅最高可達95%，同時含水量越高的組別中，兒茶素含量的最終測定值越低，同樣呈現反比例關系。間隔30 d、45 d、60 d對茶堆中兒茶素含量進行測定，發(fā)現A組樣本含量出現了急劇下降，原茶堆測定平均值為72.62 mg·g-1，但間隔30 d之后的測定值平均只有5.21 mg·g-1，間隔45 d后測定并沒有發(fā)現明顯變化，至60 d后均降至0 mg·g-1；B茶堆降幅稍緩，但同樣持續(xù)下降，間隔60 d以后2組14個處理的兒茶素含量均達到0 mg·g-1，這說明含水量對該物質的消耗影響不強，相關關系不明顯。兒茶素測定結果見表1。

表1 兒茶素測定結果表

在表兒茶素沒食子酸酯（ECG）含量的測定中，2組均出現明顯下降，30 d后平均值由原本的32.12 mg·g-1、36.24 mg·g-1下 降 到 了 6.52 mg·g-1、5.87 mg·g-1， 間隔60 d后進行再次測定，發(fā)現2組14個處理中表兒茶素沒食子酸酯含量降速減緩，最終測定數值為3.17 mg·g-1、2.11 mg·g-1，含水量越高的組別中，該物質含量越低，二者之間同樣為反相關關系。表兒茶素沒食子酸酯測定結果見表2。

表2 表兒茶素沒食子酸酯測定結果表

在普洱茶2組試樣中，沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）含量整體呈現下降趨勢，間隔30 d的測定數值中，該種變化并不明顯，后隨著發(fā)酵過程的推進，A組樣本沒食子兒茶素沒食子酸酯含量降幅明顯增大，下降速度加快，45 d后測定值已經達到0 mg·g-1，而B組樣本則要等到60 d之后，才達到零含量，這說明含水量高低可以影響沒食子兒茶素沒食子酸酯轉換速度，但總量之間并不會出現明顯的相關關系。沒食子兒茶素沒食子酸酯測定結果見表3。

表3 沒食子兒茶素沒食子酸酯測定結果表

伴隨發(fā)酵進程的深化，表沒食子兒茶素（EGC）含量緩慢下降，2組茶堆均在首次翻堆后出現大幅度下降，含水量越高的組別中，降幅最大，并且會在后續(xù)的測定中最先達到低點，到發(fā)酵結束，2組平均含量分別為 1.62 mg·g-1、0.77 mg·g-1，說明含水量、表沒食子兒茶素含量之間是存在反相關關系的，同時含水量高的狀態(tài)下，轉化速度會相對較快。表沒食子兒茶素測定結果見表4。

表4 表沒食子兒茶素測定結果表

對表兒茶素（EC）含量進行跟蹤測定后發(fā)現，直至45 d的測定試驗中，2個組別14個處理均未出現明顯變化，但后期含水量較高的A組中，表兒茶素含量下降速度明顯增快。表兒茶素測定結果見表5。

表5 表兒茶素測定結果表

間隔30 d、45 d、60 d對茶堆中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）含量進行測定，發(fā)現初次測定含量就出現了急劇下降，原茶堆測定平均值分別為45.59 mg·g-1和 46.17 mg·g-1，但間隔 30 d 后測定值只有 0.71 mg·g-1、0.69 mg·g-1，間隔 45 d 后并沒有發(fā)生明顯變化，至發(fā)酵完成，3組表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量均達到0 mg·g-1，這說明含水量對該物質的消耗影響不大，相關關系不明顯。表沒食子兒茶素沒食子酸酯測定結果見表6。

表6 表沒食子兒茶素沒食子酸酯測定結果表

綜合分析后可以發(fā)現，兒茶素總量與水含量之間，呈現負相關關系，不同含水量對EGC、ECG、EC含量影響較大，但對EGCG、GCG含量的影響并不明顯。

在本試驗所選取的兒茶素單體中，EGC、EC又可被劃分為簡單兒茶素，其收斂性、苦澀味均相對較弱，而EGCG、GCG可被劃分為酯型兒茶素，其苦澀味更加濃烈，識別閾值相對較低。以此為依據展開相關性分析時發(fā)現，A組簡單兒茶素、酯型兒茶素的含量在貯藏初期較高，B組相對較低，但伴隨貯藏、發(fā)酵的推進，兩類兒茶素之間的含量差異實際上呈現出不斷擴大的趨勢，在最終發(fā)酵產品中，A組兩類兒茶素含量均為最低。分析后認為，該種現象的產生主要是由于酯型兒茶素在濕熱環(huán)境中穩(wěn)定性下降，水解轉化為了簡單兒茶素，同時在酶促氧化、自動氧化作用下，也使其發(fā)生了一定消耗。而簡單兒茶素含量雖然伴隨酯型兒茶素分解而增加，但在酶促氧化的影響下，又同時被不斷消耗，最終導致了成品含量的降低。由此可以發(fā)現，普洱茶中簡單兒茶素、酯型兒茶素總量與水含量之間主要呈現負相關關系，含水量為40%左右的組別中，兩類兒茶素含量出現最低值。

2.3 茶色素總量變化

多羥基是茶多酚化學結構中主要的、共通的一種特性，這種結構很容易發(fā)生氧化、脫氫反應，并進一步生成醌，最終聚合形成褐變物質，茶黃素（Theaflavin，TF）、茶紅素（Thearubigins，TR）、茶褐素（Tea brown，TB）等均是極具代表性的種類，其中TB味道較淡，可以使茶湯發(fā)暗；TR可溶于水，以游離狀態(tài)存在，是構成茶色的主要成分，還可以影響滋味的強度，三者在貯存環(huán)節(jié)的比例關系、轉化情況在一定程度上決定了普洱茶的總體品質。

前述分析中，已經基本確定了茶多酚、含水量之間是存在相關關系的，推測這可能是由于含水量越多的茶堆中，化合物反應進程越頻繁，多酚被充分轉化成了其他物質，對茶色素含量的跟蹤、測定進一步證實了這一作用機理。其中茶黃素與含水量的相關關系并不明顯，A10組茶黃素含量在30 d達到最低點，約為0.017 mg·g-1，但后續(xù)緩慢上升至 0.062 mg·g-1；A25 組中茶黃素含量則波動較大，于30 d時達到0.092 mg·g-1，45 d時再進行測定，已經下降到0.065 mg·g-1，60 d重新檢測時，卻在一定程度上恢復變?yōu)?.083 mg·g-1（變化情況可見圖3、圖4）。B組處理中茶黃素含量同樣沒有明顯規(guī)律可循。分析后認為，這可能是由于多酚類物質轉化生成茶黃素，但伴隨發(fā)酵進程的推進，這部分茶黃素發(fā)生新的氧化反應，進而轉化成了茶褐素，導致了波動情況的產生，整體上與前文推測的作用機理并不矛盾。實踐測定中還發(fā)現，伴隨含水量增加，2組茶樣中茶紅素含量并沒有明顯的相關性變化，其中B20組較為特殊，茶紅素含量并未發(fā)生太大變化（變化情況可見圖5、圖6）。A茶樣茶褐素測定過程中，相關關系不明確，其中A10組水含量26.44%，最終測得茶褐素含量最高，可達3.59%，而A30組樣本含水量41.44%，最終測得茶褐素含量最低，為2.61%。B組中B0組的茶褐素含量最高，間隔60 d后可達3.41%（變化情況可見圖7、圖8）。

圖3 A組茶黃素含量變化圖

圖4 B組茶黃素含量變化圖

圖5 A組茶紅素含量變化圖

圖6 B組茶紅素含量變化圖

圖7 A組茶褐素含量變化圖

圖8 B組茶褐素含量變化圖

總體來看，在普洱茶貯藏過程中，茶色素的轉變過程是相對復雜的，茶葉中微生物不斷代謝活動，分泌產生胞外酶，在茶堆濕熱的輔助下，對多酚類物質產生影響，使其部分轉化為鄰醌。從化學性質上看，這種初級氧化產物的穩(wěn)定性較差，會進一步生成次級氧化產物，即茶黃素，部分鄰醌還會在環(huán)境影響下，發(fā)生還原反應，生成黃烷醇類物質，呈現出無定型粉末狀態(tài)，易于氧化和聚合，由于分離純化難度較大，試驗中有時會被忽視。伴隨渥堆發(fā)酵進程深化，茶黃素含量持續(xù)減少，在氧化縮合作用下產生茶紅素，某種程度上可以說茶黃素、茶紅素均是渥堆環(huán)節(jié)的中間產物，經歷復雜生化反應后，兩種茶色素均在不同程度上發(fā)生氧化反應，促進茶褐素的生成，茶褐素又反過來作用分解，轉化為其他物質，所以與含水量并未呈現出明顯的相關關系，部分組別中茶色素生成量與消耗量相抵消，因此含量波動并不明顯。

3 結論

綜上所述，水分是促成普洱茶多酚類物質轉化的重要因素，水分的增加有助于加快普洱茶發(fā)酵進程，緩解其苦澀口感，同時促進茶色素的累積，在加工、渥堆過程中，要科學控制含水量，促進其滋味品質的提升。