齊墩果酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備與藥效學(xué)評(píng)價(jià)

邢小燕,董 舒,果秋婷

1.咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,咸陽(yáng) 712000;2.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院,咸陽(yáng) 712000

齊墩果酸(oleanolic acid,OA)是從女貞子果實(shí)中提取分離得到的一種五環(huán)三萜類化合物,具有廣譜抗菌活性[1],臨床上已用于肺炎、急性扁桃體炎、牙周炎以及泌尿系統(tǒng)感染等疾病的治療,近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸能夠抑制血糖升高[2]。齊墩果酸在水中的溶解性較差,且是P-糖蛋白(P-gp)的底物,存在外排現(xiàn)象[3],其口服生物利用度較差。已有文獻(xiàn)報(bào)道將齊墩果酸制成不同種類的藥物遞送系統(tǒng)以提高藥物的溶解性,包括固體分散體[4]、納米混懸劑[5]、脂質(zhì)體[6]、環(huán)糊精包合物[7]以及納米粒[8]等。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carriers,NLCs)為新一代脂質(zhì)納米給藥系統(tǒng),它是將生物相容性良好的固體脂質(zhì)與液體脂質(zhì)作為載體,將藥物包裹在混合脂質(zhì)中,以增加藥物的溶解度和生物利用度[9]。聚乙二醇1 000維生素E琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethyleneglycol 1 000 succinate,TPGS)親水/親脂平衡(hydrophile lipophilic balance,HLB)值為13.2,具有一定的乳化和增溶作用[10],更重要的是,TPGS能夠逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)對(duì)藥物的外排作用,可提高藥物的生物利用度[11]。本研究將齊墩果酸制備成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(OA-NLCs),同時(shí)在處方中加入TPGS對(duì)OA-NLCs進(jìn)行修飾,并通過(guò)Caco-2細(xì)胞單層模型、藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)TPGS-OA-NLCs的藥物吸收效果,為改善齊墩果酸的臨床療效提供一種有效的解決方案。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DH92-IIN型超聲波破碎儀(上海狄昊實(shí)業(yè)有限公司);JEOL JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社);Zetasizer Nano ZS 90型激光粒度測(cè)定儀(英國(guó)Malvern公司);DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);LC-100型高效液相色譜系統(tǒng)(上海伍豐科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

齊墩果酸原料藥(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.5%,批號(hào)1900214,艾美捷科技有限公司);齊墩果酸對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.1%,批號(hào)110709-201808,中國(guó)食品藥品檢定研究院);山崳酸甘油酯(compritol-888 ATO,德國(guó)巴斯夫公司);丙二醇單辛酸酯(capryol 90,嘉法獅上海貿(mào)易有限公司);泊洛沙姆188(德國(guó)巴斯夫公司);TPGS(杭州樂(lè)信康寧醫(yī)藥科技有限公司);乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 細(xì)胞

Caco-2細(xì)胞購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞中心。

1.4 動(dòng)物

SD大鼠購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào)2145801474,許可證號(hào)SX-2007-004。

2 方法與結(jié)果

2.1 OA-NLCs與TPGS-OA-NLCs的制備

本研究采用改進(jìn)的熱熔乳化-超聲波法制備OA-NLCs[12]。制備工藝:①稱取處方量的Compritol-888 ATO 1.0 g和Capryol 90 0.5 g,加入5 mL乙醇中,攪拌溶解,再加入齊墩果酸原料藥0.2 g,攪拌溶解,得到透明狀油性溶液,放入75 ℃水浴中保溫;②稱取泊洛沙姆188 0.4 g加入純化水20 mL中,攪拌溶解,得到透明狀水相溶液,將溶液平均分成2份,一份置于75 ℃水浴中保溫,另一份置于冰水浴(0～5 ℃)中保存,備用;③維持75 ℃恒溫水浴,將油相溶液滴入熱的水相溶液中,高速磁力攪拌,并在50 ℃減壓下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇;④將混合物加入冷的水相溶液中,持續(xù)磁力攪拌30 min,形成乳狀液體;⑤將混合物加入超聲玻璃管中,通過(guò)超聲波細(xì)胞破碎儀超聲處理,超聲參數(shù)設(shè)置為超聲5 s,間歇5 s,超聲功率200 W,超聲時(shí)間5 min;⑥超聲結(jié)束后,迅速將其置于冰水浴中,充分冷卻,得到外觀呈淡藍(lán)色透明狀的OA-NLCs溶液。

TPGS-OA-NLCs與OA-NLCs的處方組成、輔料用量以及制備工藝參數(shù)完全相同,只是在步驟②中將TPGS 0.1 g溶解于冰水中,最終制備得外觀呈淡藍(lán)色透明狀的TPGS-OA-NLCs溶液。將制備得到的OA-NLCs與TPGS-OA-NLCs置于4 ℃保存,備用。

2.2 OA-NLCs與TPGS-OA-NLCs性質(zhì)的研究

2.2.1粒徑、Zeta電位的測(cè)定 用馬爾文動(dòng)態(tài)激光粒度儀檢測(cè)OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的粒徑分布、多聚分散系數(shù)(polydispersity index,PDI)和Zeta電位。在分析之前,將樣品放置在25 ℃下平衡2 min。每個(gè)樣品平行測(cè)量3次,結(jié)果見表1。

表1 OA-NLCs與TPGS-OA-NLCs制劑性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定,與OA-NLCs的粒徑相比,TPGS-OA-NLCs的粒徑減小,這可能是由于TPGS是表面活性劑,在處方中可進(jìn)一步降低體系的界面張力,容易形成更小粒徑的納米粒,但是處方中加入TPGS也使其包封率出現(xiàn)降低的趨勢(shì)。Zeta電位的絕對(duì)值越大,體系的穩(wěn)定性越好,研究表明,只有當(dāng)Zeta電位的絕對(duì)值超過(guò)30 mV時(shí),通過(guò)靜電斥力才能有效避免納米粒聚集[13],經(jīng)測(cè)定OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的Zeta電位絕對(duì)值均大于30 mV,有利于提高納米粒的物理穩(wěn)定性。

2.2.2微觀結(jié)構(gòu)觀察 用透射電子顯微鏡觀察OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的微觀形態(tài)。分別取OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs,經(jīng)蒸餾水稀釋后,各取1滴置于碳涂層的銅網(wǎng)格表面,水分自然揮干,滴加磷鎢酸溶液(質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1)染色10 min,水分自然揮干,將2個(gè)樣品放置在透射電鏡下觀察,并拍攝電鏡照片,見圖1。

注:A.OA-NLCs;B.TPGS-OA-NLCs。

由圖1可見,OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs均呈球狀,視野中未觀察到藥物結(jié)晶顆粒,通過(guò)電鏡照片比較可知,TPGS-OA-NLCs的大部分納米粒粒徑比OA-NLCs小,這也驗(yàn)證了Zetasizer Nano-ZS的測(cè)定結(jié)果。

2.2.3體外藥物釋放研究 用透析袋擴(kuò)散法評(píng)價(jià)OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs在體外的藥物釋放情況。取OA-NLCs、TPGS-OA-NLCs以及OA乙醇溶液(質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1)各2 mL分別放入透析袋中,釋放介質(zhì)為pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液200 mL,并加入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的Tween-80作為增溶劑,在37 ℃下以50 r·min-1的攪拌速度將透析袋完全浸入到釋放介質(zhì)中,并在固定的時(shí)間間隔(0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h)內(nèi)取出釋放介質(zhì)3 mL(補(bǔ)加同溫同體積空白介質(zhì)),用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,濾液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用HPLC法檢測(cè)藥物含量,計(jì)算藥物質(zhì)量濃度,繪制藥物累積釋放量-時(shí)間曲線,見圖2。

圖2 OA乙醇溶液、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的體外藥物釋放曲線

由圖2可見,齊墩果酸乙醇溶液中的藥物在2 h內(nèi)釋放完全,而OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs均表現(xiàn)為持續(xù)、緩慢地藥物釋放過(guò)程,且藥物釋放量基本同步,在前2 h藥物釋放量基本一致,大約有25%的藥物從載體中釋放出來(lái),在隨后的24 h內(nèi)累計(jì)約有85%的藥物釋放。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究

將Caco-2單層細(xì)胞用于研究OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs從細(xì)胞頂端(apical,AP)到基底外側(cè)(basolateral,BL)(AP→BL,表示吸收過(guò)程)和BL到AP(BL→AP,表示分泌過(guò)程)的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)特征。將Caco-2細(xì)胞置于含有質(zhì)量濃度為100 g·L-1的胎牛血清(100 u·mL-1青霉素和100 u·mL-1鏈霉素)的培養(yǎng)基中孵育21 d(孵化條件:37 ℃,二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%,測(cè)定跨上皮電阻(trans-epithelium electrical resistant,TEER)值為(456.5±27.6) Ω·cm-2,表明緊密的Caco-2單層細(xì)胞模型已成功構(gòu)建[14],在轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)開始前,用預(yù)熱的(37 ℃)空白漢克平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS)淋洗Caco-2單層細(xì)胞3次,備用。配制含有不同質(zhì)量濃度OA原料藥、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的HBSS作為供試液,分別取各組溶液1.0 mL加入Caco-2單層細(xì)胞的頂端(AP),并向基底外側(cè)(BL)加入空白HBSS 2.5 mL作為接收液,在固定的時(shí)間點(diǎn)從BL側(cè)取接收液0.3 mL(同時(shí)補(bǔ)加同體積空白HBSS),離心后取上清液經(jīng)HPLC法測(cè)定藥物含量;按上述操作,測(cè)定各組溶液從BL側(cè)向AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物含量,按照公式(1)和(2)計(jì)算表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficient,Papp)和外排比(efflux ratio,ER)。結(jié)果見表2。

表2 OA原料藥、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs在Caco-2細(xì)胞單層中的滲透性

(1)

(2)

其中dQ/dt是接收液中齊墩果酸的穩(wěn)態(tài)透過(guò)率,C0是供試液中齊墩果酸的初始質(zhì)量濃度,A是Caco-2單層細(xì)胞的面積,Papp(AP→BL)是齊墩果酸從頂端轉(zhuǎn)運(yùn)到基底外側(cè)的Papp值,Papp(BL→AP)是齊墩果酸從基底外側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到頂端的Papp值。

研究結(jié)果顯示,OA原料藥從BL側(cè)到AP側(cè)的Papp(BL→AP)值為(0.81±0.26)×10-6cm·s-1,而從AP側(cè)到BL側(cè)的Papp(AP→BL)值為(2.42±0.38)×10-6cm·s-1,ER值為2.99,該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[15],表明齊墩果酸很可能是P-gp的底物[16];OA-NLCs的Papp(BL→AP)和Papp(AP→BL)值分別為(1.59±0.24)×10-6和(1.47±0.33)×10-6cm·s-1,ER值為1.08,與OA原料藥相比降低了2.77倍,這是由于較小粒徑的納米顆粒容易被細(xì)胞內(nèi)吞,促進(jìn)藥物吸收[17];TPGS-OA-NLCs的Papp(BL→AP)和Papp(AP→BL)值分別為(0.84±0.19)×10-6和(2.46±0.39)×10-6cm·s-1,其ER值為0.34,分別比OA原料藥和OA-NLCs降低了8.79和3.18倍,一方面是由于TPGS-OA-NLCs通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),促進(jìn)藥物吸收,另一方面處方中加入TPGS,能夠顯著抑制P-gp的活性,降低了P-gp對(duì)齊墩果酸的外排作用[18]。

2.4 藥效學(xué)評(píng)價(jià)

取SD大鼠,體質(zhì)量為(220±20) g,雌雄各半,通過(guò)大鼠腹腔注射四氧嘧啶溶液誘發(fā)糖尿病,建立大鼠糖尿病模型(空腹血糖大于300 mg·dL-1)。將糖尿病大鼠隨機(jī)分成4組,每組3只,第1組大鼠作為空白對(duì)照,灌胃給予飲用水,第2組大鼠灌胃給予OA混懸液(藥物分散在質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的羧甲基纖維素鈉中),第3組大鼠灌胃給予OA-NLCs,第4組大鼠灌胃給予TPGS-OA-NLCs,給藥劑量均為100 mg·kg-1,并在0、1、2、4、6、8、10、12、24 h經(jīng)眼眶后神經(jīng)叢采血0.1 mL,用葡萄糖檢測(cè)試劑盒測(cè)定血糖水平,比較OA混懸液、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs降血糖的效果。結(jié)果見圖3。

圖3 口服OA混懸液、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs后大鼠體內(nèi)的血糖水平比較

由圖3可見,糖尿病大鼠在分別口服OA混懸液、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs后,血糖水平均出現(xiàn)降低趨勢(shì),口服TPGS-OA-NLCs大鼠在各時(shí)間點(diǎn)的血糖水平明顯低于口服OA-NLCs和OA混懸液的大鼠,進(jìn)一步說(shuō)明TPGS-OA-NLCs促進(jìn)了藥物吸收,降血糖效果顯著。

3 討論

齊墩果酸自身的溶解度及其透過(guò)胃腸道黏膜的能力(滲透性)是影響藥物口服生物利用度的2個(gè)最重要的因素。改善齊墩果酸的溶解度可以通過(guò)制劑技術(shù),但是如何提高齊墩果酸的滲透性仍是一個(gè)難點(diǎn)。Caco-2細(xì)胞是來(lái)自于人類腸道的腫瘤細(xì)胞,通過(guò)體外培養(yǎng)即可得到在形態(tài)和功能上與人類小腸上皮層相似的單層結(jié)構(gòu),更重要的是,Caco-2細(xì)胞之間存在緊密連接,形成腸道吸收的限速屏障,這是小腸上皮層的特征,Caco-2單層細(xì)胞模型已廣泛用于預(yù)測(cè)藥物及制劑經(jīng)口服給藥的腸道滲透性。因此,本研究采用Caco-2單層細(xì)胞模型評(píng)價(jià)OA原料藥、OA-NLCs和TPGS-OA-NLCs的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)特征。

P-gp是一種存在于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其功能是保護(hù)細(xì)胞免受外來(lái)有害分子的侵害[19]。由于齊墩果酸是P-gp的底物,存在外排現(xiàn)象,故嚴(yán)重影響了藥物的腸道吸收。TPGS是一種安全的藥用輔料,已被美國(guó)藥典收錄,且TPGS能夠逆轉(zhuǎn)P-gp的外排泵作用,促進(jìn)藥物吸收,因此,本研究將齊墩果酸制備成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體,在該處方的基礎(chǔ)上加入TPGS,不僅可增加藥物的溶解性,而且可提高藥物的滲透性,最終通過(guò)大鼠藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TPGS-OA-NLCs能有效提高藥物的降血糖效果。本研究可為提高齊墩果酸的治療效果奠定基礎(chǔ)。