利拉魯肽改善2型糖尿病大鼠牙周炎的機(jī)制

陳 晨,陳 棟,陸 珂,王 茜

1.商丘市中心醫(yī)院口腔科,商丘 476000;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院正畸科,鄭州 450052

牙周病是發(fā)生在牙周組織的一種慢性破壞性進(jìn)行性疾病,是導(dǎo)致成年人牙齒損傷及缺失的主要原因[1]。牙周炎患者血清中炎性因子水平升高,與胰島素敏感性的降低密切相關(guān)[2]。糖尿病患者牙周病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度均高于非糖尿病患者,當(dāng)用利拉魯肽(liraglutide,LIRA)處理原發(fā)性2型糖尿病大鼠時(shí),大鼠骨小梁和皮層骨礦物質(zhì)的密度增加,骨微結(jié)構(gòu)缺陷改善[3]。也有研究表明,LIRA可以降低腫瘤壞死因子或高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[4]。因此,本研究主要分析LIRA對(duì)2型糖尿病大鼠牙周炎牙槽骨吸收及骨重建的作用,探討其作用機(jī)制,為口腔醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACCU-CHEK ACTIVE型羅氏血糖儀及配套試紙(德國(guó)羅氏公司);ST-360型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司);Micro-CT[惠森生物科技(上海)有限公司];CX23型生物顯微鏡(日本Olympus公司);1658033型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

LIRA(國(guó)藥準(zhǔn)字J20160037,批號(hào)180316,丹麥諾和諾德制藥有限公司);兔抗大鼠脂聯(lián)素(adiponectin,ADPN),骨鈣素(osteocalcin,OC),骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG),核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL),核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factorκB,RANK)單抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(批號(hào)分別為ab133347、ab93876、ab255723、ab281216、ab239607、ab6721),均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;空腹胰島素(fasting insulin,FINS),腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(批號(hào)分別為190619、190327、190118),均購(gòu)自上海市瑞番生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD雄性大鼠70只,體質(zhì)量100～110 g,4周齡,由上海南方模式生物科技股份有限公司提供,生產(chǎn)許可號(hào)SCXK(滬)2019-0002。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前于室溫23～25 ℃、濕度60%～65%、人工12 h晝/夜循環(huán)照明、分籠飼養(yǎng),自由攝食及飲水。

2 方法

2.1 建模及分組

隨機(jī)取55只大鼠,用30 g·L-1的戊巴比妥鈉30 mg·kg-1腹腔注射麻醉,仰臥固定,用絲線結(jié)扎上頜右側(cè)第一磨牙2～3圈,在牙齦上縫一針固定絲線,剩余15只大鼠作為對(duì)照組,對(duì)照組不做手術(shù)處理。從實(shí)驗(yàn)當(dāng)天起,建模大鼠用高糖高脂飼料喂養(yǎng),對(duì)照組用常規(guī)飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)1個(gè)月后,禁食不禁水12 h,建模大鼠按30 mg·kg-1腹腔注射質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的鏈脲佐菌素溶液(用0.1 mmol·L-1檸檬酸緩沖液冰浴配制,現(xiàn)配現(xiàn)用);對(duì)照組腹腔注射等體積的0.1 mmol·L-1檸檬酸緩沖液。注射后禁食3 h,給予大鼠質(zhì)量濃度為3 g·mL-1的葡萄糖溶液預(yù)防低血糖。3 d后,所有大鼠禁食12 h,尾靜脈采血測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG≥16.7 mmol·L-1,且維持1周以上,視為造模成功。同時(shí),肉眼檢查大鼠牙齦組織有充血、出血、腫脹、溢膿、潰瘍和糜爛等現(xiàn)象,并且牙齦指數(shù)≥2,即牙周炎建模成功。國(guó)際通用牙齦指數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]:牙齦健康為0分;牙齦輕度炎癥,即牙齦的顏色有輕度改變并有輕度水腫,探診不出血為1分;牙齦有中等炎癥,即牙齦色紅,水腫光亮,探診出血為2分;牙齦有嚴(yán)重炎癥,即牙齦明顯紅腫或有潰瘍,并有自動(dòng)出血傾向?yàn)?分。將建模成功的47只大鼠隨機(jī)分為模型組15只,LIRA組、LIRA+ADPN組,各16只。

2.2 干預(yù)方法

LIRA在無(wú)菌環(huán)境下用生理鹽水稀釋成質(zhì)量濃度為300 μg·mL-1的溶液。LIRA+ADPN組腹腔注射300 μg·kg-1LIRA和10 μg·kg-1ADPN;LIRA組腹腔注射300 μg·kg-1LIRA和等量生理鹽水;模型組和對(duì)照組注射等量生理鹽水。LIRA和ADPN均每天注射1次,間隔4 h,共注射30 d。

2.3 各組大鼠FBG、FINS水平檢測(cè)

所有大鼠禁食12 h,尾靜脈取血,取血后用血糖儀測(cè)定各組大鼠藥物干預(yù)0、15、30 d的FBG水平。末次干預(yù)后,大鼠禁食12 h,尾靜脈取血,以3 000 r·min-1,離心10 min,取上層血清,用ELISA試劑盒檢測(cè)FINS的水平,按照試劑盒說明書加樣,測(cè)定450 nm處的吸光度(A),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算FINS的水平。

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平檢測(cè)

取血清,用ELISA測(cè)定TNF-α和IL-1β的水平。分別按照TNF-α和IL-1βELISA試劑盒說明書中的步驟加樣,用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A),通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得TNF-α和IL-1β的質(zhì)量濃度。

2.5 Micro-CT觀察各組大鼠釉牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂?shù)木嚯x

處死大鼠,分離上頜骨、上槽牙、牙組織和牙周組織,各組留5只大鼠牙周組織保存于-80 ℃,其余用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定24 h,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行修整,保留右側(cè)磨牙區(qū)段頜骨及牙周組織,去除其余組織,進(jìn)行三維CT拍攝,測(cè)量釉牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂(cemento enamel junction to the aleolar crest,CEJ-AC)的距離,對(duì)牙槽骨吸收情況進(jìn)行觀察。

2.6 HE染色觀察牙周組織病理變化及牙齦指數(shù)

用體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛對(duì)上頜骨、上槽牙、牙組織及牙周組織固定24 h后,用質(zhì)量濃度為10 g·mL-1的鹽酸脫鈣,用流水沖洗2 h,用梯度乙醇脫水(高體積分?jǐn)?shù)到低體積分?jǐn)?shù)),用石蠟包埋,切片(厚4～5 μm),用蘇木精染色5 min,用流水沖洗1 s,用質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的鹽酸乙醇分化1 s,水洗30 s,用促藍(lán)液反藍(lán)10 s,用流水沖洗10 min,用蒸餾水洗1 min,用曙紅液染色3 min,用蒸餾水洗1 min,梯度乙醇脫水(低體積分?jǐn)?shù)到高體積分?jǐn)?shù)),用二甲苯透明5 min,用中性樹膠封片,于光學(xué)顯微鏡下觀察牙齦、牙周膜和牙槽骨等牙周組織病變。

2.7 Western blot檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平

取保存于-80 ℃的大鼠牙周組織,置于液氮中研磨,加入蛋白提取裂解液,裂解后離心,取上清液,進(jìn)行蛋白定量后,95 ℃水浴使蛋白變性,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,電轉(zhuǎn)至PVDF膜,用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂牛奶室溫封閉2 h,洗膜后分別加入1∶1 000稀釋的OC、OPG、RANKL和RANK一抗,4 ℃孵育過夜,洗膜后加入經(jīng)1∶4 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG,室溫孵育1 h,洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影,采用Image J軟件分析圖像,以β-actin為內(nèi)參,OC、OPG、RANKL和RANK蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠FBG及FINS水平

干預(yù)0 d,與對(duì)照組比較,模型組、LIRA組和LIRA+ADPN組大鼠FBG水平升高(P<0.05),且模型組、LIRA組和LIRA+ADPN組大鼠FBG水平無(wú)明顯差異(P>0.05);與對(duì)照組比較,模型組、LIRA組和LIRA+ADPN組大鼠干預(yù)15、30 d FBG以及FINS水平升高,且FBG、FINS水平模型組>LIRA+ADPN組>LIRA組(P<0.05);隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)照組、模型組FBG水平無(wú)明顯變化(P>0.05),LIRA組、LIRA+ADPN組FBG水平逐漸降低(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠FBG及FINS水平的比較

3.2 大鼠血清TNF-α、IL-1β水平

大鼠血清TNF-α、IL-1β水平組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組、LIRA組和LIRA+ADPN組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05);與模型組比較,LIRA組、LIRA+ADPN組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平降低,且LIRA組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平低于LIRA+ADPN組(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的比較

3.3 大鼠CEJ-AC值

大鼠CEJ-AC值組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組、LIRA組和LIRA+ADPN組大鼠CEJ-AC值升高(P<0.05);與模型組比較,LIRA組、LIRA+ADPN組大鼠CEJ-AC值降低,且LIRA組大鼠的CEJ-AC值低于LIRA+ADPN組(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠CEJ-AC值的比較

3.4 大鼠牙周組織的病理變化及牙齦指數(shù)

對(duì)照組大鼠牙周組織正常;模型組大鼠牙齦組織糜爛、潰瘍,炎性細(xì)胞形成,牙周袋出現(xiàn)并加深,牙槽骨骨吸收陷窩形成;LIRA組和LIRA+ADPN組大鼠牙齦組織破壞情況得到改善,炎性細(xì)胞減少,牙周袋逐漸變淺,牙周間隙逐漸恢復(fù)正常,出現(xiàn)新生牙槽骨,且LIRA組修復(fù)效果更好。牙齦指數(shù)分別為:模型組(2.19±0.27)分、LIRA組(0.68±0.07)分、LIRA+ADPN組(1.15±0.13)分,牙齦指數(shù)組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.247,P<0.05)。與模型組比較,LIRA組和LIRA+ADPN組牙齦指數(shù)降低(t=12.105,7.760,P<0.05);與LIRA組比較,LIRA+ADPN組牙齦指數(shù)升高(t=7.118,P<0.05)。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠牙周組織的病理變化(HE×200)

3.5 大鼠牙周組織蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

大鼠牙周組織OC、OPG、RANKL、RANK蛋白的相對(duì)表達(dá)水平組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組、LIRA組和LIRA+ADPN組OC和OPG蛋白的相對(duì)表達(dá)水平降低,RANKL、RANK蛋白的相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組比較,LIRA組、LIRA+ADPN組OC和OPG蛋白的相對(duì)表達(dá)水平升高,RANKL、RANK蛋白的相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05);與LIRA組比較,LIRA+ADPN組OC和OPG蛋白的相對(duì)表達(dá)水平降低,RANKL、RANK蛋白的相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05)。結(jié)果見表4、圖2。

圖2 大鼠牙周組織蛋白的表達(dá)水平

表4 大鼠牙周組織蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較

4 討論

糖尿病易造成患者機(jī)體免疫力下降、牙槽骨吸收,影響患者牙周炎的恢復(fù)[6-7]。牙周炎與糖尿病相互影響,前者可影響糖尿病患者的代謝, 后者使發(fā)生炎癥的風(fēng)險(xiǎn)提高,治療時(shí)需要兼顧二者。

LIRA能調(diào)節(jié)患者糖脂代謝、改善胰島功能,還具有抗炎作用和骨保護(hù)作用[8]。因此,探究LIRA對(duì)2型糖尿病大鼠牙周炎牙槽骨吸收及骨重建的作用,對(duì)于臨床治療牙周炎具有理論指導(dǎo)作用。

糖尿病使機(jī)體處于高炎癥狀態(tài),IL-1β和TNF-α的水平顯著升高,從而損害牙周組織[9-10]。陸威等[11]研究發(fā)現(xiàn),可通過抑制IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平,減輕糖尿病大鼠牙齦組織炎癥反應(yīng)。吳曉靜等[12]研究發(fā)現(xiàn),LIRA通過抑制NF-κB、TNF-α和IL-6的表達(dá),改善胰島素抵抗大鼠的腎功能。張瑤等[13]研究表明,LIRA通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)及IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,改善高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的大鼠海馬組織損傷。以上研究均表明LIRA具有明顯抗炎作用。本研究中,與模型組比較,LIRA組干預(yù)15、30 d FBG、FINS、TNF-α和IL-1β水平降低,LIRA組牙齦組織破壞情況得到改善,牙齦指數(shù)降低,CEJ-AC值降低,表明LIRA可使炎癥反應(yīng)減輕,改善牙周組織損傷,降低FBG、FINS水平,緩解2型糖尿病。

血清中OC的水平與骨中OC的水平呈正相關(guān),可用作骨形成的生物學(xué)指標(biāo)[14]。OPG和RANKL參與破骨細(xì)胞的分化和活化,在牙周炎牙槽骨吸收過程中起重要作用[15-16]。RANK是RANKL的功能受體,主要在破骨細(xì)胞前體和成熟破骨細(xì)胞表面表達(dá)。在骨吸收過程中,RANKL、RANK和OPG三者共同參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化[17-18]。研究顯示,RANKL及其受體RANK可調(diào)節(jié)前體骨細(xì)胞的分化,刺激破骨細(xì)胞的形成,導(dǎo)致牙槽骨的吸收[19]。而OPG則通過與RANKL高親合性結(jié)合,抑制其促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的作用。陳洪燕等[20]研究表明,通過調(diào)控OPG/RANKL/RANK通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá),可顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度。本研究中,LIRA組OC、OPG蛋白的相對(duì)表達(dá)水平升高,RANKL、RANK蛋白的相對(duì)表達(dá)水平降低,且LIRA+ADPN組OC、OPG蛋白的相對(duì)表達(dá)水平低于LIRA組,RANKL、RANK蛋白的相對(duì)表達(dá)水平高于LIRA組,表明LIRA通過上調(diào)OPG、下調(diào)RANKL和RANK抑制2型糖尿病大鼠牙周炎牙槽骨吸收,促進(jìn)骨重建。

綜上所述,LIRA通過激活OPG/RANKL/RANK通路改善2型糖尿病大鼠牙周炎牙槽骨的吸收,促進(jìn)骨重建。