沉默lncRNA SNHG22上調(diào)miR-27a-3p增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性

趙曉燕,謝 競(jìng),吳 迪,李軍濤

1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院乳腺外科,鄭州 450000;2.河南省腫瘤醫(yī)院乳腺科,鄭州 450000

乳腺癌是女性常見的一種惡性腫瘤,多發(fā)生于年輕女性,發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。阿霉素(adriamycin,ADM)是用于治療乳腺癌的化療藥物。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類不被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA,通過吸附于miRNA在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、浸潤(rùn)過程中發(fā)揮調(diào)控作用[1-2],此外,miRNA可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[3-4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA核仁小RNA宿主基因22(long non-coding RNA small nucleolar RNA host gene 22,lncRNA SNHG22)與卵巢癌的預(yù)后不良和化療耐藥密切相關(guān)[5]。miR-27a作為一種致癌基因,其通過在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),調(diào)節(jié)細(xì)胞的耐藥過程[6]。本研究旨在探討lncRNA SNHG22是否能通過miR-27a調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超凈工作臺(tái)(沈陽市醫(yī)療器械二廠);培養(yǎng)箱(美國(guó)NAPCO公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)Coulter公司)。

1.2 試藥

阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司);MTT試劑盒、GAPDH、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistant protein,BCRP/ABCG2)抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司);含有siSNHG22、siSNHG22-NC、SNHG22、SNHG22-NC的pcDNA3.1重組質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國(guó)Sigma公司);DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物所。

2 方法

2.1 建立MCF-7/ADM耐藥細(xì)胞株

將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素和100 u·mL-1鏈霉素的培養(yǎng)基中,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí),用胰蛋白酶消化,傳代。

采用ADM低質(zhì)量濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)的方法[7]建立MCF-7/ADM耐藥細(xì)胞株,ADM的質(zhì)量濃度依次為100、200、300、400、500 ng·mL-1。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度為5×107個(gè)·mL-1,取10 mL細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中,24 h后,加入質(zhì)量濃度為100 ng·mL-1的ADM,置于培養(yǎng)箱中孵育48 h,棄去培養(yǎng)基,用PBS清洗2次,加入新鮮不含ADM的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,按照上述步驟反復(fù)培養(yǎng),最終MCF-7/ADM耐藥細(xì)胞系可耐受質(zhì)量濃度為500 ng·mL-1的ADM。所有耐藥實(shí)驗(yàn)需在撤去ADM 2周后進(jìn)行。

2.2 耐藥指數(shù)測(cè)定

分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞和經(jīng)不同質(zhì)量濃度ADM處理的MCF-7/ADM細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度為1×105個(gè)·mL-1,接種于96孔板,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,每孔加入細(xì)胞懸液100 μL,另設(shè)空白組(僅加入培養(yǎng)基)。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,空白組每孔加入培養(yǎng)基200 μL,MCF-7/ADM組每孔加入含不同質(zhì)量濃度ADM的培養(yǎng)基200 μL,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,取出96孔板,每孔加入MTS單溶液20 μL,將96孔板置于酶標(biāo)儀上,于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)得吸光度(A),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100%。用50%抑制濃度(IC50)計(jì)算軟件得出各組IC50值。

耐藥指數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50值÷親本細(xì)胞IC50

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADM細(xì)胞(用質(zhì)量濃度為500 ng·mL-1的ADM處理),隨機(jī)分為MCF-7/ADM組、si-NC組、si-SNHG22組、SNHG22 -NC組和SNHG22組。制成細(xì)胞密度為1×105個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液,接種于96孔板,每孔加入細(xì)胞懸液1 mL。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,si-NC組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒,si-SNHG22組轉(zhuǎn)染SNHG22沉默質(zhì)粒,SNHG22-NC組轉(zhuǎn)染SNHG22過表達(dá)陰性對(duì)照質(zhì)粒,SNHG22組轉(zhuǎn)染SNHG22過表達(dá)質(zhì)粒。24 h后,在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果,當(dāng)轉(zhuǎn)染成功率達(dá)到85%時(shí),進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,加入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT 20 μL,37 ℃避光振蕩10 min,置于酶標(biāo)儀上,測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A),計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(藥物組A值/空白組A值)×100%。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用胰蛋白酶消化,以3 000 r·min-1離心10 min,離心半徑為8 cm,收集細(xì)胞。用500 μL binding buffer重懸細(xì)胞,加入annexin V-FITC結(jié)合液5 μL,混勻,再加入碘化丙啶10 μL混勻,避光冰浴15 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)lncRNA SNHG22和miR-27a-3p的靶向關(guān)系

通過生物信息學(xué)分析軟件檢測(cè)到SNHG22與miR-27a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。將該結(jié)合位點(diǎn)的序列片段進(jìn)行克隆,插入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒中,構(gòu)建野生型SNHG22報(bào)告基因質(zhì)粒(SNHG22-wt)和突變型SNHG22報(bào)告基因質(zhì)粒(SNHG22-mut)。將2種質(zhì)粒分別與miR-27a-3p mimic和miR-27a-3p mimic-NC共轉(zhuǎn)染到MCF-7/ADM細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,以3 000 r·min-1離心15 min,離心半徑為8 cm,用熒光素酶試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶的活性。以海參熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值反映SNHG22與miR-27a-3p的結(jié)合強(qiáng)度。

2.7 qRT-PCR檢測(cè)miR-27a-3p和lncRNA SNH G22的表達(dá)

轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用胰蛋白酶消化,以3 000 r·min-1離心15 min,離心半徑8 cm,收集細(xì)胞。用Trizol試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書中的步驟逆轉(zhuǎn)錄出cDNA,配制熒光定量PCR反應(yīng)體系,95 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s;58 ℃ 40 s;共40個(gè)循環(huán)。用熒光定量PCR儀測(cè)定lncRNA SNHG22和miR-27a-3p的表達(dá)水平,所有組均進(jìn)行5次重復(fù)操作。分別以GAPDH和U6為內(nèi)參,用2-CT法計(jì)算lncRNA SNHG22和miR-27a-3p相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 lncRNA SNHG22和miR-27a-3p引物序列

2.8 蛋白印跡法檢測(cè)耐藥蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,加入裂解液,于冰上靜置30 min。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液,100 ℃煮沸10 min,使蛋白變性,配制濃縮膠和分離膠,每個(gè)樣品上樣20 μL。120 V恒壓電泳1.5 h后,取下凝膠進(jìn)行濕轉(zhuǎn),0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h。室溫封閉1 h,加入P-gp、BCRP、GAPDH一抗(1∶1 000),置于4 ℃孵育過夜,用TBST洗膜3次,每次5 min,加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,用TBST洗膜3次,每次5 min。用ECL法顯色,用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值,以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)量。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 耐藥指數(shù)測(cè)定結(jié)果

MCF-7細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度ADM處理后,均出現(xiàn)耐藥性,且耐藥指數(shù)隨ADM質(zhì)量濃度的增大而升高。結(jié)果見表2。

表2 各組耐藥指數(shù)比較

3.2 lncRNA SNHG22相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

lncRNA SNHG22相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MCF-7/ADM組和si-NC組比較,si-SNHG22組lncRNA SNHG22的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05);與MCF-7/ADM組和SNHG22-NC組比較,SNHG22組lncRNA SNHG22的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05);與si-SNHG22組比較,SNHG22組lncRNA SNHG22的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組細(xì)胞lncRNA SNHG22表達(dá)水平比較

3.3 細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果

與MCF-7/ADM組比較,si-NC組、si-SNHG22組、SNHG22-NC組細(xì)胞存活率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與si-SNHG22組比較,SNHG22組細(xì)胞的存活率降低(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組細(xì)胞存活率比較

3.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果

與MCF-7/ADM組和si-NC組比較,si-SNHG22組細(xì)胞的凋亡率降低(P<0.05);與MCF-7/ADM組和SNHG22-NC組比較,SNHG22組細(xì)胞的凋亡率升高(P<0.05);與si-SNHG22組比較,SNHG22組細(xì)胞的凋亡率升高(P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 各組細(xì)胞凋亡率比較

3.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果

轉(zhuǎn)染miR-27a-3p mimic可明顯抑制SNHG22-wt相對(duì)熒光素酶活性,對(duì)SNHG22-mut無明顯影響。結(jié)果見圖1、表6。

圖1 lncRNA SNHG22與miR-27a-3p的結(jié)合位點(diǎn)

表6 各組相對(duì)熒光素酶活性比較

3.6 miR-27a-3p相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

miR-27a-3p相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MCF-7/ADM組和si-NC組比較,si-SNHG22組miR-27a-3p的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05);與MCF-7/ADM組和SNHG22-NC組比較,SNHG22組miR-27a-3p的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05);與si-SNHG22組比較,SNHG22組miR-27a-3p的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。結(jié)果見表7。

表7 各組細(xì)胞miR-27a-3p表達(dá)量的比較

3.7 耐藥蛋白P-gp、BCRP表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

P-gp、BCRP蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MCF-7/ADM組和si-NC組比較,si-SNHG22組P-gp、BCRP蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05);與MCF-7/ADM組和SNHG22-NC組比較,SNHG22組P-gp、BCRP蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05);與si-SNHG22組比較,SNHG22組P-gp、BCRP蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。結(jié)果見表8、圖2。

表8 各組細(xì)胞P-gp、BCRP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注:A.MCF-7/ADM組;B.si-NC組;C.si-SNHG22組;D.SNHG22-NC組;E.SNHG22組。

4 討論

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤,在組織形態(tài)、生物學(xué)行為及免疫表型等方面存在巨大差異,給醫(yī)療系統(tǒng)和個(gè)人帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[8]。目前,對(duì)于癌癥的治療常以手術(shù)切除為主,化療為輔,但長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用化療藥物,導(dǎo)致癌細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性,極大降低化療藥物的治療效果。癌細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制復(fù)雜,多種因素可導(dǎo)致癌細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性,多藥耐藥蛋白高表達(dá)是主要原因,參芪扶正注射液通過降低多藥耐藥相關(guān)蛋白7增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌對(duì)紫杉醇和吉西他濱的敏感性[9]。

通過將質(zhì)量濃度遞增的ADM持續(xù)作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞,建立MCF-7/ADM耐藥細(xì)胞株,檢測(cè)耐藥指數(shù)。結(jié)果顯示,MCF-7/ADM細(xì)胞的耐藥性隨ADM質(zhì)量濃度的提高逐漸增強(qiáng)。lncRNA CASC9促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌對(duì)吉非替尼的耐藥性[10];lncRNA ZXF1表達(dá)水平升高促進(jìn)肺癌細(xì)胞順鉑耐藥[11];lncRNA PCAT-1沉默增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性[12]。lncRNA SNHG22已被報(bào)道通過結(jié)合miRNA,促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞、食管癌細(xì)胞及甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[13-15]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,沉默lncRNA SNHG22對(duì)細(xì)胞生存率無影響,過表達(dá)可降低細(xì)胞生存率,沉默lncRNA SNHG22細(xì)胞凋亡率降低,過表達(dá)后凋亡率升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示lncRNA SNHG22參與調(diào)控MCF-7/ADM細(xì)胞的耐藥性。

miR-27a是細(xì)胞內(nèi)高度保守的非編碼RNA,在前列腺癌、肝癌以及骨肉瘤的耐藥過程中具有調(diào)節(jié)作用,靶向調(diào)控miR-27a的表達(dá)或作用于其上、下游信號(hào)可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性[16-18]。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法證明lncRNA SNHG22與miR-27a-3p具有結(jié)合位點(diǎn),沉默lncRNA SNHG22能夠使MCF-7/ADM細(xì)胞中miR-27a-3p的表達(dá)水平上調(diào)。P-gp和BCRP蛋白是與耐藥性密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。P-gp是一種多藥耐藥泵,具有同時(shí)結(jié)合多種藥物分子的能力,它的混雜性是癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的主要原因,通過外轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將多種藥物分子泵出細(xì)胞外,從而降低腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感度[19]。BCRP作為一種ATP依賴性藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,廣泛存在于細(xì)胞膜上,其可能主要通過參與膜內(nèi)、外藥物轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮作用[20]。本研究中,沉默lncRNA SNHG22后,P-gp和BCRP蛋白的表達(dá)量升高,而lncRNA SNHG22過表達(dá)則降低P-gp和BCRP蛋白的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,lncRNA SNHG22可調(diào)節(jié)P-gp和BCRP蛋白的表達(dá)水平。

綜上所述,沉默lncRNA SNHG22增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的耐藥性,其可能的機(jī)制是上調(diào)miR-27a-3p,提高P-gp和BCRP蛋白的表達(dá)水平,為臨床治療乳腺癌提供潛在的治療靶點(diǎn)。