α-倒捻子素衍生物合成及其抑制磷酸二酯酶4活性研究*

鄧金輝，黃悅，梁津豪，朱嘉琪，于思，劉昊柏，羅海彬，黃儀有，何細(xì)新

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

2. 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

磷酸二酯酶（PDEs，phosphodiesterase）是水解細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)腺苷酸（cAMP）或（和）環(huán)鳥苷酸（cGMP）的超級(jí)酶家族，共包括11 個(gè)酶家族（PDE1～11）［1］。由于cAMP 和cGMP 在生理活動(dòng)中的重要作用，磷酸二酯酶已成為多種疾病，如心衰、銀屑病、肺動(dòng)脈高血壓、認(rèn)知障礙等的重要治療靶點(diǎn)［2］。磷酸二酯酶4（PDE4s，phosphodiesterase 4）是PDE 家族的一種同工酶，有PDE4A、PDE4B、PDE4C 和PDE4D 四種亞型，可特異性水解cAMP［3］，廣泛分布于炎性細(xì)胞、免疫細(xì)胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中，對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP 濃度及其下游信號(hào)傳導(dǎo)具有重要的調(diào)控作用［4-6］。PDE4 型抑制劑藥物已被廣泛研究用于多種疾病治療。Rolipram 作為第一代PDE4 抑制劑，被廣泛研究用于哮喘等疾病治療，但因?qū)ζ渌麃喰瓦x擇性差，常伴有頭暈、頭痛、惡心和嘔吐等副作用，因此常被用作PDE4抑制劑研究的陽性對(duì)照藥物［7］。Roflumilast 是首個(gè)上市的PDE4 抑制劑（PDE4B IC50：0.84 nmol/L；PDE4D IC50：0.68 nmol/L），2010 年和2011 年先后被歐洲藥物管理局（EMA）和FDA 批準(zhǔn)用于嚴(yán)重慢性阻塞性肺?。–OPD）治療，以減少突然發(fā)作的次數(shù)或防止COPD 癥狀惡化［8］；Apremilast 是一種口服的選擇性PDE4 抑制劑（IC50：74 nmol/L），2014 年被FDA 批準(zhǔn)用于中至重度斑塊型銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎的治療［9-10］。2016年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了首個(gè)外用PDE4抑制劑Crisaborole（IC50：490 nmol/L）用于特應(yīng)性皮炎的治療［11］。然而，PDE4 抑制劑通常伴有嘔吐、惡心等不良作用，很大程度上阻礙了臨床應(yīng)用［12］。因此，尋找新型PDE4抑制劑具有重要意義。

α-倒捻子素，一種來自藤黃科藤黃屬植物山竹Garcinia mangostanaL. 中的異戊烯基型氧雜蒽酮骨架類化合物，具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性［13-16］。前期研究證實(shí)，α-倒捻子素是一種中等活性的PDE4D2 抑制劑（IC50=1 310 nmol/L），對(duì)其2-位異戊烯基氧化環(huán)合后所得中間體進(jìn)一步修飾，發(fā)現(xiàn)在6-位酚羥基上引入烷基羧酸或烷基吡咯烷基團(tuán)后可顯著提高其抑制PDE4活性［17］。為進(jìn)一步比較6-位含氮堿性側(cè)鏈及其他基團(tuán)對(duì)PDE4抑制活性的影響，本研究設(shè)計(jì)合成了11 個(gè)α-倒捻子素衍生物，并初步探討其抑制PDE4構(gòu)效關(guān)系。

1 合成路線

按照本課題組報(bào)道的合成方法［17］，α-倒捻子素物經(jīng)DDQ 氧化環(huán)合得到α-倒捻子閉環(huán)衍生物1，然后在6-位酚羥基上經(jīng)烷基化、還原、水解、?；确椒ê铣赡繕?biāo)化合物。目標(biāo)化合物合成路線見圖1～圖4。

圖1 中，化合物1 與不同鏈長(zhǎng)的二溴烷烴反應(yīng)得到中間體2a 和2b，接著與疊氮化鈉反應(yīng)得到化合物3a和3b，將3a和3b經(jīng)三苯基膦還原得到目標(biāo)化合物4a 和4b，4b 與1H-吡唑-1-甲脒鹽酸鹽反應(yīng)制得含胍基目標(biāo)化合物5。

圖1 化合物4a、4b和5的合成Fig.1 The synthesis of compounds 4a,4b and 5

圖2中，化合物1與乙酰氯反應(yīng)得到6，6與4-溴巴豆酸乙酯烷基化得到7，最后7 水解得到目標(biāo)化合物8。

圖2 化合物6和8的合成Fig.2 The synthesis of compounds 6 and 8

圖3 中，化合物1 與相應(yīng)的羧酸化合物在DCC和DMAP 反應(yīng)條件下得到化合物9、10和11?；衔?與相應(yīng)的溴代化合物發(fā)生烷基化反應(yīng)得到化合物12和13。

圖3 化合物9～13的合成Fig.3 The synthesis of compounds 9-13

圖4 中，按照本課題組前期報(bào)道的合成方法［17］，化合物1 與7-溴庚酸乙酯經(jīng)烷基化、水解反應(yīng)得到化合物14，14 與單溴甲基川芎嗪反應(yīng)得到目標(biāo)化合物15。

圖4 化合物15的合成Fig.4 The synthesis of compound 15

2 合成實(shí)驗(yàn)

1H NMR（400 MHz）和13C NMR（100 MHz）譜采用瑞士Bruker AV400 核磁共振儀測(cè)定（以TMS 為內(nèi)標(biāo)）；ESI-MS 采用安捷倫科技有限公司1260-6460三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀；HR-MS（ESI）采用美國(guó)AB SCIEX TripleTOF?5600+質(zhì)譜儀測(cè)定；柱色譜硅膠（200～300 目）為青島海洋化工公司產(chǎn)品，高效硅膠GF254板（20 cm×20 cm）為德國(guó)默克公司；除溴甲基川芎嗪外其他化學(xué)反應(yīng)試劑均通過商業(yè)途徑購(gòu)置，反應(yīng)溶劑均為分析純。

2.1 化合物1、2a、2b的合成

化合物1、2a、2b的合成參考文獻(xiàn)［17］。

2.2 化合物3a、3b的合成

以3a 的合成為例。將2a（300 mg，0.57 mmol）加入至3 mL 干燥DMF 中，依次加入疊氮化鈉（111 mg，1.70 mmol）和碘化鈉（9 mg，0.06 mmol）。60 ℃下反應(yīng)5 h 后， 加入10 mL 冰水，二氯甲烷（10 mL×3）萃取。合并二氯甲烷相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸除溶劑。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化（乙酸乙酯-石油醚，體積比1∶19），得黃色固體3a（268.2 mg），收率為96%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.73（s，1H），6.74（s，1H），6.73（d，J= 10.0 Hz，1H），6.23（s，1H），5.57（d，J=10.0 Hz，1H），5.26～5.20（m，1H），4.17（t，J=6.0 Hz，2H），4.11（d，J= 6.6 Hz，2H），3.79（s，3H），3.59（t，J= 6.5 Hz，2H），2.16（p，J= 6.2 Hz，2H），1.85（s，3H），1.68（s，3H），1.47（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.1，159.9，158.1， 157.2， 156.3， 155.4， 144.2， 137.5，132.0， 127.3， 123.2， 115.9， 112.2， 104.6，104.0，99.2，94.1，78.1，65.6，61.1，48.2，28.7，28.5，26.3，26.1，18.3。ESI-MSm/z514.1［M+Na］+。

同法，化合物2b 與疊氮化鈉反應(yīng)，得目標(biāo)化合物3b：黃色固體，收率為90%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.76（s，1H），6.73（d，J= 10.1 Hz，1H），6.71（s，1H），6.22（s，1H），5.56（d，J= 10.0 Hz，1H），5.27～5.20（m，1H），4.11（d，J= 6.7 Hz，2H），4.08（t，J= 6.4 Hz，2H），3.79（s，3H），3.33（t，J= 6.6 Hz，2H），1.97～1.89（m，2H），1.85（s，3H），1.75～1.69（m，2H），1.68（s，3H），1.66～1.60（m，2H），1.46（s，6H）。13C NMR （100 MHz，CDCl3）δ182.2，159.8，158.1， 157.6， 156.3， 155.4， 144.2， 137.3，132.0， 127.2， 123.3， 115.9， 111.9， 104.6，104.0，99.0，94.1，78.0，68.6，61.0，51.4，28.7，28.7，28.4，26.3，26.1，23.5，18.3。ESIMSm/z520.3［M+H］+。

2.3 目標(biāo)化合物4a、4b的合成

以4a 的合成為例。三苯基膦（174 mg， 0.66 mmol）緩慢加入至3a（251 mg，0.51 mmol）的四氫呋喃（3 mL）溶液中，60 ℃回流反應(yīng)2 h后，加入1.5 mL 蒸餾水，繼續(xù)反應(yīng)7.5 h。反應(yīng)完畢，減壓蒸除四氫呋喃，加入20 mL蒸餾水，乙酸乙酯萃?。?0 mL×2）。合并乙酸乙酯相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸除溶劑。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱純化（甲醇-二氯甲烷，體積比1∶9），得到黃色固體4a（163.8 mg），收率為69%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ6.72（s，1H），6.71（d，J= 10.0 Hz，1H），6.21（s，1H），5.55（d，J= 10.0 Hz，1H），5.29～5.19（m，1H），4.16（t，J= 6.1 Hz，2H），4.10（d，J= 6.6 Hz，2H），3.78（s，3H），2.98（t，J= 6.8 Hz，2H），2.04（p，J= 6.4 Hz，2H），1.84（s，3H），1.67（s，3H），1.46（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.1，159.8，158.1，157.6，156.3， 155.4， 144.2， 137.2， 131.9， 127.2，123.3，115.9，111.9，104.6，104.0，99.1，94.1，78.0，67.0，61.0，39.2，32.6，28.4，26.3，26.0，18.3。ESI-HRMSm/z：488.203 4［M+Na］+（488.204 4，calcd for C27H31NNaO6）。

同法，化合物3b 和三苯基膦反應(yīng)，得目標(biāo)化合物4b：黃色固體，收率為69%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ6.72（d，J= 10.2 Hz，1H），6.70（s，1H），6.21（s，1H），5.55（d，J= 10.0 Hz，1H），5.26 ～ 5.20（m，1H），4.10（d，J= 6.5 Hz，2H），4.07（t，J= 6.4 Hz，2H），3.78（s，3H），2.76（t，J= 6.4 Hz，2H），1.95～1.87（m，2H），1.84（s，3H），1.67（s，3H），1.60～1.57（m，2H），1.57～1.54（m，2H），1.46（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2，159.8，158.1，157.7，156.3， 155.4， 144.2， 137.2， 131.9， 127.2，123.3，115.9，111.8，104.6，104.0，99.0，94.1，78.0，68.8，61.0，41.9，32.8，28.9，28.4，26.3，26.1，23.5，18.3。ESI-HRMSm/z：494.252 7［M+H］+（494.253 7，calcd for C29H36NO6）。

2.4 目標(biāo)化合物5的合成

向化合物4b（110 mg，0.22 mmol）的干燥DMF（1.2 mL）溶液中依次加入1H-吡啶-1-甲脒鹽酸鹽（96.7 mg，0.66 mmol）、N，N′-二異丙基乙胺（DIPEA，110 μL，0.66 mmol），室溫反應(yīng)15 h。反應(yīng)完畢，向反應(yīng)液中加入20 mL蒸餾水，少許碳酸氫鈉調(diào)pH 至堿性，過濾。殘留物經(jīng)硅膠柱層析純化（甲醇-二氯甲烷，體積比1∶9→氨水-甲醇，體積比1∶1），得到黃色固體5（55.0 mg），收率為47%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ6.54（d，J=10.0 Hz，1H），6.45（s，1H），6.06（s，1H），5.43（d，J=10.0 Hz，1H），5.25～5.14（m，1H），4.09～3.92（m，2H），3.88～3.73（m，2H），3.69（s，3H），3.19～2.94（m，2H），1.78（s，3H），1.75～1.67（m，2H），1.64（s，3H），1.62～1.53（m，2H），1.46～1.33（m，2H），1.39（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ181.5，168.8，159.7，157.7，157.0， 156.1， 155.1， 143.6， 137.0， 131.6，127.0，123.4，115.7，111.8，104.6，103.8，98.9，94.0，78.0，68.7，60.9，41.2，29.8，28.9，28.4，26.2，26.0，23.6，18.3。ESI-MSm/z：536.275 8［M+H］+（536.275 5，calcd for C30H37N3O6）。

2.5 化合物6的合成

化合物1（700 mg，1.71 mmol）和三乙胺（1.36 mL，10.28 mmol）依次加入到20 mL 干燥二氯甲烷中，然后在冰浴條件下緩慢注入乙酰氯（0.73 mL， 10.28 mmol）。冰浴條件下反應(yīng)5 h 后，常溫反應(yīng)10.5 h。減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化（乙酸乙酯-石油醚，體積比1∶19），得到黃色固體6（538.5 mg），收率為70%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.49（s，1H），7.10（s，1H），6.72（d，J= 10.0 Hz，1H），6.25（s，1H），5.58（d，J=10.0 Hz，1H），5.27～5.18（m，1H），4.13（d，J=6.2 Hz，2H），3.77（s，3H），2.39（s，3H），1.83（s，3H），1.68（s，3H），1.47（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2，168.2，160.5，158.1，156.4， 153.9， 149.0， 146.7， 139.0， 132.3，127.4， 123.0， 117.0， 115.7， 110.7， 104.7，104.1，94.4，78.3，61.8，28.5，26.5，26.0，21.0，18.3。ESI-HRMSm/z：451.175 5［M+H］+（451.175 1，calcd for C26H27O7）。

2.6 化合物7的合成

化合物6（500 mg，1.22 mmol）加入至20 mL干燥丙酮中，然后依次加入碳酸鉀（230 mg，1.66 mmol）和4-溴巴豆酸乙酯（0.18 mL，1.33 mmol），55 ℃加熱回流反應(yīng)12 h。減壓蒸除溶劑后，水（10 mL）-乙酸乙酯（10 mL×3）萃取。合并乙酸乙酯相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸除溶劑。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化（乙酸乙酯-石油醚，體積比1∶19），得到黃色固體7（56.3 mg），收率為10%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.70（s，1H），7.11（dt，J= 15.8，4.1 Hz，1H），6.73（d，J= 10.1 Hz，1H），6.71（s，1H），6.27 ～ 6.20（m，2H），5.57（d，J=10.0 Hz，1H），5.28～5.20（m，1H），4.84（dd，J= 4.0，1.9 Hz，2H），4.24（q，J= 7.1 Hz，2H），4.14（d，J= 6.5 Hz，2H），3.83（s，3H），1.85（s，3H），1.69（s，3H），1.47（s，6H），1.31（t，J= 7.1 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.1，165.9，160.0，158.1，156.5， 156.4， 155.3， 144.3， 140.8， 138.0，132.2， 127.3， 123.1， 122.9， 115.9， 112.6，104.7，104.1，99.6，94.2，78.1，67.4，61.2，60.9，28.5，26.4，26.1，18.3，14.4. ESI-MSm/z：521.2［M+H］+。

2.7 目標(biāo)化合物8的合成

將鹽酸羥胺（13 mg， 0.19 mmol）和氫氧化鈉（19 mg， 0.48 mmol）依次加入5 mL 干燥丙酮中。室溫?cái)嚢?0 min 后，將化合物7（50 mg，0.10 mmol）加入反應(yīng)中，與50 ℃中反應(yīng)7 h。反應(yīng)完畢，減壓蒸除溶劑，加水10 mL，φ=5%稀硫酸溶液調(diào)pH 至1，乙酸乙酯（10 mL×3）萃取。合并乙酸乙酯相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸除溶劑。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱純化（乙酸乙酯-石油醚，體積比1∶4），得到黃色固體8（20.1 mg），收率為41%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.62（s，1H），6.86（s，1H），6.73（d，J= 10.0 Hz，1H），6.62（dt，J= 5.9，1.5 Hz，1H），6.23（s，1H），5.57（d，J=10.0 Hz，1H），5.32～5.25（m，1H），5.24 ～ 5.19（m，1H），4.14（d，J= 6.5 Hz，2H），3.83（s，3H），3.40（dd，J= 7.1，1.4 Hz，2H），1.85（s，3H），1.69（s，3H），1.46（s，6H）。13C NMR （100 MHz，CDCl3）δ182.2，175.9，160.2， 158.1， 156.4， 154.9， 154.8， 144.4，141.4， 138.6， 132.3， 127.4， 123.0， 115.8，114.0，106.4，104.7，104.1，102.3，94.2，78.2，61.5，29.6，28.5，26.4，26.1，18.3。ESI-HRMSm/z：493.186 7［M+H］+（493.186 7，calcd for C28H29O8）。

2.8 目標(biāo)化合物9～11的合成

以化合物9 的合成為例。將化合物1（100 mg，0.24 mmol）、衣康酸單甲酯（54 mg，0.38 mmol）和DMAP（6 mg，0.05 mmol）依次加入5 mL 干燥二氯甲烷溶液中，然后將環(huán)己基碳二亞胺（68 mg，0.33 mmol）的二氯甲烷（1 mL）溶液滴入，常溫反應(yīng)21.5 h。反應(yīng)完畢，減壓蒸除溶劑，水（10 mL）-二氯甲烷（10 mL×3）萃取。合并二氯甲烷相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸除溶劑。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化（乙酸乙酯-石油醚，體積比1∶19），得到黃色固體9（65.4 mg），收率為51%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.49（s，1H），7.16（s，1H），6.72（d，J= 10.0 Hz，1H），6.64（s，1H），6.24（s，1H），6.00（s，1H），5.57（d，J=10.0 Hz，1H），5.23（d，J= 6.7 Hz，1H），4.14（d，J= 6.5 Hz，2H），3.75（s，3H），3.74（s，3H），3.49（s，2H），1.83（s，3H），1.68（s，3H），1.46（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2，170.8， 163.7， 160.5， 158.1， 156.4， 153.9，148.9， 146.8， 139.0， 133.0， 132.3， 131.2，127.4， 123.0， 117.0， 115.7， 110.7， 104.7，104.1，94.4，78.3，62.0，52.4，37.5，28.5，26.5，26.0，18.3。ESI-HRMSm/z：557.178 6［M+Na］+（557.178 2，calcd for C30H30NaO9）。

同法，化合物1 與硫辛酸反應(yīng)，得目標(biāo)化合物10：黃色固體，收率為23%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.48（s，1H），7.08（s，1H），6.71（d，J= 10.0 Hz，1H），6.23（s，1H），5.57（d，J=10.0 Hz，1H），5.21（d，J= 6.8 Hz，1H），4.12（d，J= 6.7 Hz，2H），3.74（s，3H），3.60（p，J=7.7 Hz，1H），3.25～3.15（m，1H），3.15～3.07（m，1H），2.66（t，J= 7.1 Hz，2H），2.54～2.42（m，1H），1.99～1.88（m，1H），1.82（s，3H），1.78～1.71（m，2H），1.68（s，3H），1.64～1.57（m，2H），1.46（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2，170.8，160.4，158.0，156.4，153.9， 149.0， 146.7， 138.9， 132.2， 127.4，123.0， 116.9， 115.6， 110.7， 104.7， 104.1，94.3，78.2，61.8，56.4，40.4，38.6，34.7，34.1，28.8，28.5，26.5，26.0，24.6，18.3。ESIHRMSm/z：597.197 0［M + H］+（597.197 5，calcd for C32H37O7S2）。

同法，化合物1 和2-吡嗪羧酸反應(yīng)，得目標(biāo)化合物11：黃色固體，收率為32%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.47（s，1H），9.50（d，J= 1.4 Hz，1H），8.89（d，J=2.4 Hz，1H），8.85（dd，J=2.3，1.5 Hz，1H），7.29（s，1H），6.74（d，J=10.1 Hz，1H），6.28（s，1H），5.59（d，J= 10.1 Hz，1H），5.29～5.21（m，1H），4.17（d，J= 6.3 Hz，2H），3.79（s，3H），1.83（s，3H），1.69（s，3H），1.47（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2， 161.6， 160.6， 158.1， 156.4， 154.0，148.8， 148.7， 147.1， 146.6， 144.9， 142.4，139.4， 132.6， 127.5， 122.8， 117.6， 115.7，110.6，104.8，104.2，94.4，78.4，62.2，28.5，26.6，26.0，18.4。ESI-HRMSm/z：515.182 6［M +H］+（515.181 3，calcd for C29H27N2O7）。

2.9 目標(biāo)化合物12～13的合成

以化合物12 的合成為例。將化合物1（100 mg， 0.24 mmol）、 碳酸鉀 （39.8 mg，0.29 mmol） 和2-溴甲基-3，5，6-三甲基吡嗪（51.6 mg，0.24 mmol）依次加入至5 mL干燥丙酮中，室溫反應(yīng)15 h。反應(yīng)完畢，減壓蒸除溶劑，水（10 mL）-乙酸乙酯（10 mL×3）萃取。合并乙酸乙酯相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸除溶劑。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化（乙酸乙酯-石油醚，體積比1∶9），得到白色固體12（65.0 mg），收率為50%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.73（s，1H），7.00（s，1H），6.73（d，J= 10.0 Hz，1H），6.25（s，1H），5.57（d，J= 10.0 Hz，1H），5.28（s，2H），5.22（t，J= 6.5 Hz，1H），4.11（d，J=6.5 Hz，2H），3.75（s，3H），2.63（s，3H），2.54（s，3H），2.53（s，3H），1.83（s，3H），1.67（s，3H），1.47（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.2， 159.9， 158.1， 157.2， 156.4， 155.3，151.9， 150.0， 149.1， 144.6， 144.4， 137.6，132.1， 127.2， 123.2， 115.9， 112.4， 104.6，104.0，100.0，94.2，78.1，70.7，61.2，28.5，26.3，26.1，21.9，21.5，20.7，18.3。ESI-HRMSm/z：543.248 7［M + H］+（543.249 0，calcd for C32H35N2O6）。

同法，化合物1與2-（二甲氨基）溴乙烷氫溴酸鹽反應(yīng)，得目標(biāo)化合物13：黃色固體，收率為56%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.72（s，1H），6.71（d，J=10.0 Hz，1H），6.69（s，1H），6.20（s，1H），5.55（d，J= 10.0 Hz，1H），5.25～5.18（m，1H），4.17（t，J= 5.8 Hz，2H），4.09（d，J=6.5 Hz，2H），3.78（s，3H），2.84（t，J= 5.8 Hz，2H），2.36（s，6H），1.83（s，3H），1.67（s，3H），1.45（s，6H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ182.1，159.8， 158.0， 157.3， 156.3， 155.3， 144.2，137.3， 131.9， 127.2， 123.3， 115.8， 112.0，104.5，103.9，99.1，94.1，78.0，67.3，61.0，57.8，46.0，28.4，26.3，26.0，18.3。ESI-HRMSm/z：502.220 7［M + Na］+（502.220 0，calcd for C28H33NNaO6）。

2.10 化合物14的合成

化合物14的合成參考文獻(xiàn)［17］。

2.11 目標(biāo)化合物15的合成

將14（100 mg，0.19 mmol）、2-溴甲基-3，5，6-三甲基吡嗪（40 mg，0.19 mmol）和碳酸鉀（26.3 mg，0.19 mmol）依次加入至5mL 干燥丙酮中，常溫反應(yīng)6.5 h。反應(yīng)完畢，減壓蒸除溶劑，水（10 mL） -乙酸乙酯（10 mL×3） 萃取。合并乙酸乙酯相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸除溶劑。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化（乙酸乙酯-石油醚，體積比3∶17），得到黃色油狀物15 （29.6 mg）， 收率為23%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ13.77（s，1H），6.72（d，J=10.1 Hz，1H），6.70（s，1H），6.21（s，1H），5.56（d，J= 10.0 Hz，1H），5.26-5.20（m，1H），5.19（s，2H），4.10（d，J= 6.5 Hz，2H），4.05（t，J= 6.4 Hz，2H），3.78（s，3H），2.52（s，3H），2.50（s，3H），2.49（s，3H），2.40（t，J= 7.4 Hz，2H），1.92～1.86（m，2H），1.84（s，3H），1.74～1.68（m，2H），1.67（s，3H），1.57～1.49（m，2H），1.46（s，6H），1.45～1.39（m，2H）。13C NMR （100 MHz，CDCl3）δ182.2，173.4，159.8，158.1，157.7，156.3，155.4，151.4，149.1，149.0，144.9，144.2，137.2，131.9，127.2，123.3，115.9，111.8，104.6，104.0，99.0，94.1，78.0，68.8，65.1，61.0，34.1，29.8，28.9，28.9，28.4，26.3，26.1，25.9，24.9，21.8，21.6，20.6，18.3。ESI-MSm/z：671.4［M + H］+。

3 目標(biāo)化合物抑制PDE4活性

離心機(jī)（Sigma，6K15），渦旋儀（Vortexgenie），BioPhotomer 分光光度計(jì)（德國(guó)Eppendorf 公司），Ni-NTA（Qiagen，Valencia，CA）親和色譜柱，蛋白質(zhì)自動(dòng)純化系統(tǒng)（GEAkta Purifier 100），液體閃爍計(jì)數(shù)器（PerkinElmerTricarb2910）。所用試劑均為分析純。

靶標(biāo)蛋白PDE4 的表達(dá)、純化及活性測(cè)定參照本課題組已發(fā)表論文［17］。所有的化合物均用DMSO 溶解，化合物梯度稀釋，加到最終的反應(yīng)體系中，保證DMSO的濃度應(yīng)當(dāng)比1%更低。

先將表達(dá)質(zhì)粒pET15b-PDE4D2（催化結(jié)構(gòu)域，86～413）轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli菌株BL21 攜帶重組質(zhì)粒的CodonPlus 中。E.coli細(xì)胞在含100 μg/mL 氨芐青霉素、20 μg/mL 氯霉素和w=0.4%葡萄糖的LB 培養(yǎng)基中在37 ℃下生長(zhǎng)至A600＝0.7，后加入0.1 mmol/L 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，并在15 ℃培養(yǎng)20～40 h。重組的PDE4D2 催化結(jié)構(gòu)域通過Ni-NTA 親和柱純化。經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）測(cè)試可知PDE4D2（催化結(jié)構(gòu)域）蛋白質(zhì)的純度達(dá)到95%以上。

［3H］-cAMP（20 000～30 000 cpm，GE Healthcare）溶液中加入緩沖液（50 mmol/L Tris pH8.0，10 mmol/L 氯化鎂， 0.5 mmol/L 二硫蘇糖醇），待測(cè)化合物溶液，混勻。然后加入已測(cè)定濃度的上述純化的蛋白質(zhì)溶液，在25 ℃下靜置反應(yīng)15 min。加入0.2 mol/L ZnSO4和0.2 mol/L Ba（OH）2終止反應(yīng)，［3H］-AMP 沉淀析出，而上清液中保留未反應(yīng)的［3H］-cAMP。取上清液，加入2.5 mL 閃爍液，振蕩混合后用PerkinElmer 2910 液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定。每次測(cè)量至少重復(fù)3 次，至少8 個(gè)濃度。采用非線性回歸方法計(jì)算IC50值。化合物對(duì)PDE4D2 的抑制活性見表1。

表1 目標(biāo)化合物對(duì)PDE4D2的抑制活性Table 1 Inhibitory rates of the target compounds towards PDE4D2

結(jié)果表明，化合物4a、4b、5、6、8、11 和13 對(duì)PDE4 有較高的抑制活性（IC50＜1 000 nmol/L），且優(yōu)于α-倒捻子素。其中化合物5 的抑制活性最高（IC50=247 nmol/L），為α-倒捻子素抑制活性的5倍。

在α-倒捻子素2，3 位形成吡喃環(huán)的基礎(chǔ)上，與引入長(zhǎng)鏈烷基吡咯烷相比較［17］，引入脂肪胺（4a、4b、13）、胍基（5）同樣可提高PDE4 抑制活性。比較脂肪胺化合物（4a、4b、13）的PDE4 抑制活性可知，一定長(zhǎng)度的烷基鏈對(duì)活性的保持是必需的，本研究所合成的脂肪胺化合物中以胺基和α-倒捻子素母核相隔5個(gè)碳原子時(shí)活性最好。與長(zhǎng)鏈脂肪胺相比，胍基取代物5 可進(jìn)一步提高對(duì)PDE4 的抑制活性。對(duì)比前期研究中的羧酸類化合物尤其是化合物14，胺基類化合物和胍基類化合物活性較弱。但因其烷基鏈長(zhǎng)不一樣，是否因取代基團(tuán)不同所致尚需進(jìn)一步研究。

圖5 化合物5對(duì)PDE4D2的抑制曲線Fig.5 Inhibition curves of compound 5 towards PDE4D2

6 位羧酸酚酯類化合物（6、9、10、11）中，吡嗪羧酸酚酯化合物（11，IC50=421 nmol/L）的抑制活性是乙酸酯化合物（6）的兩倍，而化合物9、10 則對(duì)PDE4無活性。與化合物11相比，當(dāng)吡嗪羧酸酯部分替換為川芎嗪基團(tuán)（12）時(shí)，對(duì)PDE4 無活性，這可能與甲基的位阻有關(guān)。

當(dāng)6 位引入羧酸基團(tuán)時(shí)，抑制PDE4 活性顯著增強(qiáng)（化合物8），但末端羧基成酯后則活性顯著下降（9、15），可能由于羧基可增強(qiáng)化合物與PDE4 蛋白催化域中金屬離子相互作用所致。化合物8（IC50=281 nmol/L）與前期研究中具有相同鏈長(zhǎng)飽和烷基羧酸（丁酸） 取代化合物（IC50=44 nmol/L）比較［17］，活性下降近7倍，說明雙鍵不利于抑制PDE4 活性。與鏈長(zhǎng)為7 個(gè)碳的化合物14（IC50=16 nmol/L）比較，化合物8 活性更低，說明更長(zhǎng)的烷基鏈，有利于羧基與PDE4 催化域金屬區(qū)的相互作用提高活性，這與文獻(xiàn)［17］結(jié)論一致。

4 結(jié) 論

本文在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)α-倒捻子素2，3-位閉環(huán)產(chǎn)物的6-位酚羥基進(jìn)行修飾，設(shè)計(jì)合成了11個(gè)衍生物；體外PDE4抑制活性結(jié)果顯示7 個(gè)化合物（4a、4b、5、6、8、11 和13）的活性強(qiáng)于α-倒捻子素（IC50＜1 000 nmol/L），其中6位長(zhǎng)鏈烷基胍類化合物5 的PDE4 抑制活性最強(qiáng)（IC50=247 nmol/L），為α-倒捻子素活性的5 倍，且優(yōu)于陽性對(duì)照藥物Rolipram。