深海放線菌Actinomadura cremea中的生物堿類化合物*

陳傳兵，胡金姍，于鑫，章衛(wèi)民，張琪，張翠仙

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

2. 廣東省微生物研究所/華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州 510070

海洋放線菌是海洋微生物活性天然產(chǎn)物的重要來源［1-3］，主要包括鏈霉屬Streptomyces、微球菌屬Micrococcus、馬杜拉放線菌屬Actinomyces、小單孢菌屬Micromonospora和節(jié)桿菌屬Arthrobacter等［4］。Actinomyces屬放線菌多分布于熱帶和亞熱帶，但目前此屬次生代謝產(chǎn)物的報道主要來源于陸地放線菌屬［5］，其結(jié)構(gòu)類型主要有生物堿類、聚酮類、萜類、甾醇類和環(huán)二肽類等［6-7］，藥理活性主要為抗腫瘤和抗菌活性。如從A. alkaliterraesp. nov.中分離得到的蒽環(huán)類洋紅霉素，臨床用于治療腫瘤等疾?。?］，其同系物吡柔比星目前臨床上對急性粒細胞性白血病、急性淋巴細胞性白血病、神經(jīng)母細胞瘤和橫紋肌肉瘤等治療使用的化療藥物［9］。Müller 等［10］從海綿來源海洋放線菌Actinomadurasp. SBMs009 中分離得到甾醇類化合物，對小鼠成纖維細胞株（L929）顯示出較強的細胞毒活性。Wyche 等［11］從海洋放線菌Actinomadurasp. 中分離得到對產(chǎn)生毒素的艱難梭菌NAP1/B1/027等有極強抑菌作用的ecteinamycin，其MIC 值為59.0 ng/μL。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)海洋來源馬杜拉屬放線菌的研究報道較少，為進一步獲得結(jié)構(gòu)新穎的海洋微生物次生代謝產(chǎn)物［12-14］，本課題組對一株深海來源乳脂色馬杜拉放線菌Actinomadura cremea的次生代謝產(chǎn)物進行研究。在A1 培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，從其菌絲體與菌液的乙酸乙酯部位中，共分離得到13 個生物堿類化合物（圖1）：3 個色氨生物堿（1～3）、4個（芳香）酰胺類生物堿（4～7）和6 個二酮哌嗪類生物堿（8～13）。其中10個生物堿（1、3、4、7～13）首次從馬杜拉放線菌屬中發(fā)現(xiàn)，所有化合物均首次從放線菌Actinomadura cremea中得到。

圖1 來源于Actinomadura cremea化合物1～13Fig.1 Compounds 1-13 from Actinomadura cremea

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

實驗中微生物活化、發(fā)酵及次生代謝產(chǎn)物提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定的儀器同文獻［15］的1.1中儀器部分。本文中的次生代謝產(chǎn)物分離材料色譜柱僅用一種：色譜柱1（日本YMC 公司）：YMCPack ODS-A/S 5 μm/12 nm， 250 mm× 10.0 mm；其他分離材料及試劑同文獻［15］的1.1中材料與試劑部分。

1.2 菌種材料

馬杜拉放線菌Actinomadura cremea于2008 年分離自中國南海北部沉積泥中（E 117°32.357′，N 19°59.304′），水深2 346 m。菌株乳脂色馬杜拉放線菌Actinomadura cremea由廣東省微生物研究所饋贈，樣本編號：線-章-SS7。

1.3 微生物的發(fā)酵培養(yǎng)

1.3.1 菌種活化 放線菌線-章-SS7采用A1 培養(yǎng)基進行種子液活化。將純化菌種接種于裝有300 mL A1 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（1 L）中，密封。置于28 ℃恒溫搖床上培養(yǎng)48 h （165 r/min）。

1.3.2 規(guī)模發(fā)酵 放線菌線-章-SS7 規(guī)模發(fā)酵在A1培養(yǎng)基上進行，方法同文獻［15］1.3.2部分，共培養(yǎng)66 L。

1.4 次生代謝產(chǎn)物的提取、分離及純化

生長7 d的菌株采用XAD-7樹脂吸附、過濾分為菌體和菌液兩部分，次生代謝產(chǎn)物的提取過程見圖2；采用硅膠、ODS、Sephadex LH-20 柱色譜及制備HPLC 等進行分離、純化，得到純化合物，次生代謝產(chǎn)物的分離及純化見圖3。

圖2 放線菌Actinomadura cremea后處理及乙酸乙酯相的獲得Fig.2 EtOAc layer from Actinomadura cremea on the A1 medium

圖3 化合物1～13分離流程圖Fig.3 The separation flowing chart of 1-13

2 結(jié)果與分析

化合物1：黃色固體（MeOH）；UV 254 nm 下觀察為暗斑。ESI-MS：m/z183［M+H］+，確定其相對分子質(zhì)量為182，分子式為C12H10N2。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：8.51（1H，brs，H-9），8.12～8.14（2H，m，H-3，5），7.93（1H，d，J= 5.6 Hz，H-4），7.57（1H，d，J= 8.4 Hz，H-8），7.53（1H，dt，J=6.8，0.8 Hz，H-7），7.53（1H，m，H-6），2.81（3H，s，H-1’）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：142.9（s，C-1），142.7（s，C-8a），137.4（d，C-3），136.2（s，C-1a），130.0（s，C-4a），129.6（d，C-7），122.7（d，C-5），122.6（s，C-5a），120.9（d，C-6），114.2（d，C-4），112.9（d，C-8），19.5（q，C-1’）。以上數(shù)據(jù)與文獻［16-17］報道基本一致，故確定1 為9H-吡啶并［3，4-b］吲哚，即Harmane。

化合物2：黃色固體（MeOH）；TLC 中UV 254 nm 下觀察為暗斑，365 nm 下檢測為橙黃色斑點。ESI-MS：m/z203［M+H］+，確定其相對分子質(zhì)量為202，分子式為C12H14N2O。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：7.51（1H，d，J= 8.0 Hz，H-4），7.30（1H，d，J= 8.0 Hz，H-6），7.05（1H，dt，J= 1.2，8.0 Hz，H-5），6.99（1H，s，H-2），6.96（1H，dt，J= 1.2，8.0 Hz，H-6），3.40（2H，brt，J= 7.2 Hz，H-11），2.87（2H，brt，J= 7.2 Hz，H-10），1.84（3H，s，H-14）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：173.2（s，C-13），138.0（s，C-8），128.7（s，C-9），123.3（d，C-2），119.6（d，C-5），119.2（d，C-4），113.2（s，C-3），112.2（d，C-7），41.4（t，C-11），26.1（t，C-10），22.6（q，C-14）。以上數(shù)據(jù)與文獻［18-19］報道基本一致，故確定2為N-乙?；?。

化合物3：黃色固體（MeOH）；TLC 中UV 254 nm 下觀察為暗斑，365 nm 下檢測為橙黃色斑點。ESI-MS：m/z217［M+H］+，確定其相對分子質(zhì)量為216，分子式為C13H16N2O。1H NMR （400 M，CD3OD）δH：7.55（1H，d，J= 8.0 Hz，H-4），7.31（1H，d，J=8.0 Hz，H-7），7.08（1H，dt，J=0.8，7.2 Hz，H-5），7.05（1H，s，H-2），7.00（1H，dt，J= 0.8，7.2 Hz，H-6），3.46（2H，brt，J= 7.2 Hz，H-11），2.93（2H，brt，J= 7.2 Hz，H-10），2.16（2H，q，J=7.6 Hz，H-14），1.09（3H，t，J=7.6 Hz，H-15）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：177.0（s，C-13），138.2（s，C-8），128.8（s，C-9），123.4（d，C-6），122.3（d，C-2），119.5（t，C-5），119.4（d，C-4），113.3（s，C-3），112.2（d，C-7），41.4（t，C-11），30.3（t，C-14），26.3（t，C-10），10.5（q，C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻［19］報道基本一致，故確定3 為N-（2-（1H-吲哚-3-基）乙基）丙酰胺。

化合物4：淡紅色固體（MeOH），TLC 中UV 254 nm 下觀察為暗斑，濃硫酸-香草醛顯藍灰色。ESI-MS：m/z194［M+H］+，結(jié)合NMR 信息確定其相對分子質(zhì)量為193，分子式為C11H15NO2，不飽和度為5。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：7.00（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5），6.68（2H，d，J=8.0 Hz，H-2，6），3.32（2H，t，J=7.2 Hz，H-8），2.66（2H，t，J=7.2 Hz，H-7），2.14（2H，q，J=7.6 Hz，H-11），1.07（3H，t，J=7.6 Hz，H-12）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：177.0（s，C-10），156.9（s，C-1），131.3（s，C-4），130.7（d，C-3，5），116.2（d，C-2，6），42.3（t，C-8），35.6（t，C-7），30.2（t，C-11），10.6（q，C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻N-（4-hydroxyphenethyl）propionamide［20］對比基本一致，故確定4為N-（4-羥基苯乙基）丙酰胺。

化合物5：無色固體（MeOH），TLC 中UV 254 nm 下觀察為暗斑，濃硫酸-香草醛顯藍灰色。ESI-MS：m/z180［M+H］+，結(jié)合NMR 譜數(shù)據(jù)可推斷其分子式為C10H13NO2，不飽和度為5。與化合物4對比發(fā)現(xiàn)二者十分相似僅是丙?；兂闪艘阴；?。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：7.00（2H，d，J=7.2 Hz，H-3，5），6.69（2H，d，J=7.2 Hz，H-2，6），3.30（2H，t，J=7.2 Hz，H-8），2.66（2H，t，J=7.2 Hz，H-7），1.88（3H，s，H-10）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：173.2（s，C-9），156.9（s，C-1），131.2（s，C-4），130.7（d，C-3，5），116.2（d，C-2，6），42.4（t，C-8），35.6（t，C-7），22.5（s，C-10）。以上NMR 數(shù)據(jù)與文獻N-acetyltyramine［21-22］基本一致，故確定5為N-乙酰酪胺。

化合物6：白色固體（MeOH），TLC 中UV 254 nm 下觀察為暗斑，濃硫酸-香草醛顯藍灰色。ESI-MS：m/z164［M+H］+，結(jié)合NMR 譜數(shù)據(jù)可推斷其分子式為C10H13NO，不飽和度為5?；衔? 和5結(jié)構(gòu)十分相似，只是芳香環(huán)上比5 少了一個羥基取代。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：7.24～7.29（2H，m，H-2，6），7.14～7.23（3H，m，H-3，4，5），3.36（2H，m，H-8），2.76（2H，m，H-7），1.88（3H，s，H-11）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：173.2（s，C-10），140.5（s，C-1），129.8（d，C-3，5），129.5（d，C-2，6），127.3（d，C-4），42.1（t，C-8），36.5（t，C-7），22.5（q，C-11）。上述NMR數(shù)據(jù)與文獻N-phenethylacetamide［22-23］對比基本一致，故確定6為N-苯乙基乙酰胺。

化合物7：白色固體（MeOH），ESI-MS：m/z100［M+H］+，結(jié)合NMR 譜數(shù)據(jù)可推斷其分子式為C5H9NO，不飽和度為2。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：4.61（1H，brs，H-1），3.25（2H，m，H-6），2.28（2H，m，H-3），1.76（4H，m，H-4，H-5）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：175.0（s，C-2），43.0（t，C-6），32.0（t，C-3），23.0（t，C-5），21.7（t，C-4）。以上NMR 數(shù)據(jù)與文獻戊內(nèi)酰胺［24］對比基本一致，故確定7為戊內(nèi)酰胺。

化合物8：白色固體（MeOH），[α]28D-58.83°（c= 0.02，MeOH）。ESI-MS：m/z247［M+H］+，確定其相對分子質(zhì)量為246，分子式為C14H18N2O2。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：7.20～7.29（5H，m，H-2’～6’），4.31（1H，td，J= 1.2，4.9 Hz，H-6），3.64（1H，dd，J= 0.8，4.6 Hz，H-3），3.23（1H，dd，J= 5.2，13.6 Hz，H-7a），3.03（1H，dd，J= 4.8，13.6 Hz，H-7b），1.64（1H，m，H-8），0.80（3H，d，J= 7.0 Hz，H-9/10），0.43（3H，d，J=6.8 Hz，H-10/9）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：169.4（s，C-1），169.4（s，C-4），137.1（s，C-1’），131.5（s，C-3’，5’），129.6（d，C-2’，6’），128.2（d，C-4’），61.2（d，C-3），57.3（d，C-6），40.1（t，C-7），33.3（d，C-8），19.1（q，C-9/10），17.1（q，C-9/10）。以上數(shù)據(jù)與文獻［25-26］報道基本一致，故確定8為環(huán)（苯丙-纈）二肽。

化合物9：白色固體（MeOH），[α]28D-119.34°（c=0.1，MeOH）。ESI-MS：m/z197［M+H］+，確定其相對分子質(zhì)量為196，分子式為C10H16N2O2。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：4.20（1H，m，H-3），4.03（1H，m，H-9），3.54（1H，m，H-6a），3.51（1H，m，H-6b），2.48（1H，m，H-10），2.32（1H，m，H-9），3.54（1H，m，H-6a），3.51（1H，m，H-6b），2.48（1H，m，H-10），2.32（1H，m，H-8a），2.01（1H，m，H-8b），1.95（1H，m，H-7a），1.90（1H，m，H-7b），1.09（3H，d，J= 7.2 Hz，H-11/12），0.93（3H，d，J= 6.8 Hz，H-11/12）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：172.6（s，C-4），167.6（s，C-4），61.5（d，C-9），60.0（d，C-3），46.2（t，C-6），29.9（d，C-10），29.5（t，C-8），23.3（t，C-7），18.8（q，C-11/12），16.7（q，C-11/12）。以上數(shù)據(jù)與文獻［27-28］報道基本一致，故確定9 為環(huán)（脯-纈）二肽。

化合物10：白色固體（MeOH），[α]28D-28.54°（c= 0.16，MeOH）。ESI-MS：m/z213［M+H］+，確定其相對分子質(zhì)量為212，分子式為C11H20N2O2。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：3.94（1H，m，H-3），3.76（1H，m，H-3），2.22（1H，m，H-11），1.87（1H，m，H-8），1.75（1H，m，H-7a），1.60（1H，m，H-7b），1.03（3H，d，J= 6.4 Hz，H-12/13），0.93～0.98（9H，m，H-12/13，9，10）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：171.3（s，C-1），169.7（s，C-4），61.5（d，C-3），54.3（d，C-6），46.0（t，C-7），33.7（d，C-11），25.3（d，C-8），23.6（q，C-9/10），21.8（q，C-9/10），19.3（q，C-12/13），17.8（q，C-12/13）。以上數(shù)據(jù)與文獻［29］報道基本一致，故確定10為環(huán)（亮-纈）二肽。

化合物11：白色固體（MeOH），[α]28D-24.56°（c=0.2，MeOH）。ESI-MS：m/z171［M+H］+，確定其相對分子質(zhì)量為170，分子式為C8H14N2O2。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：4.03（1H，m，H-6），3.83（1H，m，H-3），2.26（1H，m，H-8），1.44（3H，d，J=6.8 Hz，H-7），1.04（3H，d，J=6.8 Hz，H-9，可與H-10交換），0.94（3H，d，J=6.0 Hz，H-10，可與H-9 交換）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：171.4（s，C-1），169.3（s，C-4），61.4（d，C-3），51.7（d，C-6），33.3（d，C-8），21.1（q，C-7），19.1（q，C-9/10），17.2（q，C-9/10）。以上數(shù)據(jù)與文獻［30］報道基本一致，故確定11為環(huán)（丙-纈）二肽。

化合物12：白色固體（MeOH），[α]28D-32.26°（c= 0.025，MeOH）。ESI-MS：m/z227［M+H］+，確定其相對分子質(zhì)量為226，分子式為C12H22N2O2。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：3.95（1H，ddd，J= 1.2，4.8，9.2 Hz，H-3），3.85（1H，dd，J=1.2，4.0 Hz，H-6），1.93（1H，m，H-12a），1.25（1H，m，H-12b），1.02（3H，d，J= 6.8 Hz，H-14），0.93（3H，d，J= 6.8 Hz，H-13），0.93～0.96（6H，m，H-9/ H-10）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：171.2（s，C-1），169.6（s，C-4），60.9（s，C-3），54.3（d，C-6），45.8（d，C-7），40.5（t，C-11），25.9（t，C-12），25.3（t，C-8），23.6（q，C-9/10），21.8（t，C-9/10），15.7（t，C-14），12.1（q，C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻［31］報道基本一致，故確定12為環(huán)（亮-異亮）二肽。

化合物13：白色固體（MeOH），[α]28D-26.70°（c=0.28，MeOH）。ESI-MS：m/z185［M+H］+，確定其相對分子質(zhì)量為184，分子式為C9H16N2O2。1H NMR（400 M，CD3OD）δH：4.03（1H，m，H-6），3.90（1H，m，H-3），1.96（1H，m，H-8），1.51（1H，m，H-10a），1.26（1H，m，H-10b），1.43（3H，m，H-7），1.01（3H，m，H-9），0.95（3H，m，H-11）；13C NMR（100 M，CD3OD）δC：171.3（s，C-1），169.2（s，C-4），60.9（d，C-3），51.6（d，C-6），40.2（d，C-8），25.6（t，C-10），20.9（q，C-7），15.6（q，C-9），12.2（q，C-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻［32］報道基本一致，故確定13 為環(huán)（丙-異亮）二肽。

3 結(jié) 論

本課題組對一株深海來源乳脂色馬杜拉放線菌Actinomaduracremea 的次生代謝產(chǎn)物進行了研究。從其A1 培養(yǎng)基的菌絲體與菌液的乙酸乙酯部位中，共分離得到13 個生物堿類化合物（圖1），結(jié)構(gòu)類型涉及3 個色氨類生物堿（1～3）、4 個（芳香）酰胺類生物堿（4～7）和6 個二酮哌嗪類生物堿（8～13）?；衔?、3、4、7～13 首次從Actino?madura屬中發(fā)現(xiàn)，所有化合物均首次從海洋放線菌Actinomadura cremea中得到，說明此菌富含豐富的生物堿類次生代謝產(chǎn)物。

文獻研究表明1 對鹵蟲有極強的致死活性測試，其致死率為94.6%［17］。同時研究該化合物的系列衍生物的生物活性［32］發(fā)現(xiàn)1-（benzo［d］［1，3］dioxol-5-yl）-6- methoxy-2-（4-（trifluoromethyl）-bnzyl）-9H-pyrido［3，4-b］indol-2-ium bromide 具有極強的抗菌活性，其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的殺菌能力比磷霉素鈉和氨芐西林鈉等藥物還要強，最小抑菌濃度為50 nmol/mL。Stark 等［25］報道了劑量/反應(yīng)函數(shù)關(guān)系用于測定二酮哌嗪的苦味，更準確地描述了人類對二酮哌嗪的苦味感知?；衔? 和5 具有較強的清除自由基的能力，其IC50分別是（131.3±1.8）和（64.7±0.5）μg/mL［33］。Lee 等［34］報道5 還具有抑制ADP-、collagen-或u46619-誘導(dǎo)血小板聚集，有抗血栓作用。劉海濱等［35］研究表明9 和12 在50 μg/mL 下對肝癌細胞HepG-2 的抑制率分別為17%、32%，對前列腺癌細胞LNCaP 抑制率分別為53%、43%，且化合物8、9 和12 具有一定的細胞毒活性。Lee 等［36］報道了9 作為一種抗EPCR 脫落試劑，對PMA 介導(dǎo)和CLP 介導(dǎo)的EPCR 脫落具有潛在的抑制作用。而Fdhila 等［37］報道了9 具有抗鰻弧菌的作用（MIC=0.05 μg/mL）。龍聰?shù)龋?8］研究也表明8 和12 對Hep G2細胞株均表現(xiàn)出一定的生長抑制活性，其IC50分別為88 和105 μg/mL。Xu等［39］研究表明化合物10有較弱的抗菌活性。韓冰等［30］研究表明化合物8、11 和13 顯示出具有細胞周期G0/G1期抑制活性，是首次報道此類化合物具有細胞周期抑制活性。由此可以看出放線菌不僅次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型多樣，生理活性也十分豐富。