孕期慢性應激通過胎盤GC 屏障致子代情緒損傷的機制

劉紅婭， 馬淑琴， 陳小惠， 戚發(fā)秋， 趙 楓， 付有娟， 關(guān)素珍

（1.寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，銀川 750004； 2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點實驗室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，銀川 750004）

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，兒童神經(jīng)精神性疾病，如焦慮癥、孤獨癥等受到社會的廣泛關(guān)注。越來越多的研究[1]表明，子代神經(jīng)精神類疾病的發(fā)病與母親孕期應激刺激有極大的聯(lián)系。孕期長期處于應激狀態(tài)會引起胎兒暴露于過量糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）[2]，主要為皮質(zhì)醇，通過胎盤進入宮內(nèi)，引起胎兒下丘腦-垂體-腎上腺（The hypothalamic pituitary adrenal，HPA）軸改變，導致子代情緒和認知發(fā)育異常[3]。在正常妊娠中，胎兒的GC 暴露是由胎盤GC 屏障決定的，胎盤GC 屏障需要11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅱ（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2，11β-HSD2）和P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）共同調(diào)節(jié)，以保證適量卻不超量的GC。11β-HSD2 可將GC 從有活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化為無活性狀態(tài)[4]，P-gp 能逆濃度將GC轉(zhuǎn)運到母體面[5]，且GC 受體亞家族3C 組成員1（Nuclear Receptor Subfamily 3，Group C，Member 1，NR3C1）在HPA 軸功能紊亂過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。目前，孕期慢性應激對胎盤GC 屏障的具體調(diào)節(jié)機制尚不清楚。本研究擬建立孕期慢性應激大鼠模型，觀察子鼠情緒變化，通過檢測胎盤GC 屏障相關(guān)基因的表達，探討GC 屏障與子代情緒之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

選擇成年SPF 級未曾受孕的80～90 日齡SD雌性大鼠32 只，體質(zhì)量（200±20）g，隨機分為模型組和對照組，每組16 只。模型組為單籠飼養(yǎng)，對照組4 只/籠飼養(yǎng)。90 日齡以上雄鼠24 只，體質(zhì)量（220±20）g，分為模型交配組16 只和對照交配組8 只，4 只/籠飼養(yǎng)，雄鼠只為交配所用。均購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（寧）2020-0001。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準，編號為IACUC-NYLAC-2020068。

1.2 主要試劑和儀器

131I 皮質(zhì)醇放射免疫試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所，中國），蔗糖（北京化學試劑，中國），β-actin 抗體（Santa，美國），11β-HSD2 一抗（Novus，美國），P-gp 一抗（abcam，美國），NR3C1 一抗（abcam，美國），山羊抗兔IgG 二抗（affnity，中國）等；電泳儀（北京市六一儀器廠），Smart 3.0 小動物行為學視頻記錄與分析系統(tǒng)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中國）。

1.3 孕期慢性應激模型建立

1.3.1 模型建立方法 適應性飼養(yǎng)7 d 后，選擇慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立孕期CUMS 動物模型[8]。根據(jù)實驗室條件選擇應激方式：（1）24 h 擁擠環(huán)境；（2）24 h 潮濕環(huán)境（濕度60%～70%）；（3）5 min熱水游泳（45 ℃）；（4）30 min 搖晃鼠籠；（5）行為束縛2 h；（6）5 min 冰水?。唬?）夾尾2 min（距尾根部1 cm 處）。利用隨機數(shù)字表法將7 種刺激方式隨機安排到28 d 內(nèi)，每天1 種，應激完成后放回原飼養(yǎng)籠中。

在應激周期第7 天，模型組雌鼠與模型交配組雄鼠（1∶1）進行合籠交配，次日早晨檢查雌鼠陰栓（或陰道涂片），明確妊娠后，將雌雄鼠分離，模型組孕鼠繼續(xù)單籠飼養(yǎng)，在合籠過程中，應激照常進行。對照組雌鼠與對照交配組雄鼠（2∶1）進行合籠交配，確定妊娠后，雌雄分離，對照組孕鼠4 只/籠，在孕18 d 開始單籠飼養(yǎng)。

1.3.2 確認模型成功與否 利用行為學變化及血漿皮質(zhì)酮來確認孕期CUMS 大鼠模型的成功建立[9-10]。在應激前1 d 和應激第1、7、14、21、28天內(nèi)眥靜脈采血收集血漿，-80 ℃冰箱冷凍待測。同時期進行曠場實驗（open field test，OFT）、蔗糖偏好實驗（sucrose preference test，SPT）測定母鼠的行為學。

1.4 子鼠分組及樣品收集

確認懷孕的第18 天，每組各取8 只孕鼠進行剖宮收集胎盤，-80 ℃冰箱冷凍保存。其余8只孕鼠分娩后獲得子鼠，所有子鼠于一周內(nèi)全部娩出，子鼠出生的當天記為PND0（postnatal day 0，PND0），PND21 斷乳，每組按每籠的分娩只數(shù)及性別比例從不同窩別中隨機抽取16 只子鼠（雌雄各半），記為對照子鼠組和模型子鼠組，雌雄分籠，4 只/籠飼養(yǎng)。PND28 與PND42，記錄子鼠體質(zhì)量并內(nèi)眥靜脈采血收集血漿，-80 ℃冰箱冷凍待測。

1.5 指標測定和方法

1.5.1 血漿皮質(zhì)酮測定 利用131I 皮質(zhì)醇放射免疫試劑盒測定血漿皮質(zhì)醇濃度，根據(jù)公式：C 皮質(zhì)酮=50 × C 皮質(zhì)醇，得到皮質(zhì)酮濃度。

1.5.2 母鼠行為學測定 （1）OFT[11]：選擇OFT反映箱進行實驗，呈立方體（100 cm×100 cm×50 cm），周壁為黑色，底部由25 等分的方塊組成。每只大鼠測定時間為5 min，水平運動得分以動物經(jīng)過的底面塊數(shù)計數(shù)，動物3 爪以上跨入方格內(nèi)記為1 分；垂直運動得分以直立次數(shù)計數(shù)，1 次記為1 分。并記錄清潔運動次數(shù)（大鼠做洗臉樣動作）和糞便粒數(shù)，每只大鼠開始前徹底清潔敞箱。（2）SPT[12]：分為適應訓練部分和測試部分。首先訓練大鼠適應含糖飲水，每籠放置2 個裝有1%蔗糖水的水瓶自由飲水24 h，第2 天將其中的一瓶換成純水，適應結(jié)束后，禁食禁水24 h，次日給予1 瓶1%蔗糖水，1 瓶純水，自由飲水1 h后稱重。其余時間給予正常飲食。1%蔗糖偏愛百分比=蔗糖水消耗/總液體消耗×100%。

1.5.3 子鼠行為學測定 在PND42 開始，進行子鼠行為學的測定，OFT 和SPT 具體方法同母鼠行為學測定，連續(xù)測量3 d，取平均值。在PND45時，開始懸尾實驗（tail suspension test，TST）[13]，具體操作：將大鼠呈倒懸狀態(tài)固定在TST 箱上（距子鼠尾尖約5 cm），確保子鼠頭部距臺面約為20 cm。主要指標為6 min 內(nèi)的“靜止”時間，表現(xiàn)出“失望”狀態(tài)，并追蹤子鼠的掙扎軌跡。連續(xù)測定3 d，取平均值。

1.5.4 胎盤GC 屏障相關(guān)蛋白11β-HSD2、NR3C1、P-gp 表達的測定 Western blot 測定胎盤GC 屏障相關(guān)蛋白11β-HSD2、NR3C1、P-gp 的含量，每100 mg 待測胎盤組織中加入0.8 mL RIPA Lysis Buffer 制備成勻漿后，離心，取上清，采用BCA 法進行蛋白定量。上樣緩沖液與樣品按5∶1 體積比例進行混合，上樣蛋白50 μg，進行凝膠蛋白電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠轉(zhuǎn)移至0.45 μm 的PVDF膜，封閉1 h，加入一抗，4 ℃過夜，回收一抗，加入二抗，顯色后以目的蛋白11β-HSD2、P-gp、NR3C1 與β-actin 蛋白的光密度（OD）的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗；母鼠相關(guān)數(shù)據(jù)的比較采用重復測量的方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。檢驗水準α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 孕期慢性應激致母鼠血漿皮質(zhì)酮水平增高

經(jīng)重復測量方差分析，慢性應激對母鼠皮質(zhì)酮水平有影響（F=41.399，P＜0.05），模型組皮質(zhì)酮水平隨應激時間的變化而變化（F=4.440，P＜0.001），分組與時間點的交互作用差異無統(tǒng)計學意義（F=1.134，P＞0.05）。同一時間點兩組比較發(fā)現(xiàn)，模型組血漿皮質(zhì)酮濃度在應激第14、21、28天均高于對照組（t14=2.412，P ＜0.05；t21=2.822，P＜0.05；t28=2.956，P＜0.05）。表明模型組母鼠在孕期處于應激狀態(tài)，見表1。

表1 應激對母鼠血漿皮質(zhì)酮濃度的影響（±s，ng·mL-1）

表1 應激對母鼠血漿皮質(zhì)酮濃度的影響（±s，ng·mL-1）

*P＜0.05。

組別n應激前1 d應激第1 天應激第7 天應激第14 天應激第21 天應激第28 天對照組8325.74±12.57368.31±59.20227.45±127.60285.63±81.64341.78±48.40320.43±84.76模型組8367.99±52.66388.09±77.40320.86±86.86394.02±97.41* 444.12±90.43* 463.71±107.76*?

2.2 孕期慢性應激致母鼠行為學改變

SPT 結(jié)果經(jīng)重復測量方差分析，組間比較發(fā)現(xiàn)，模型組1%蔗糖偏愛百分比與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（F組間=15.053，P＜0.05；F組內(nèi)=1.547，P＞0.05；F交叉=2.224，P＞0.05），同一時間點兩兩比較發(fā)現(xiàn)，模型組1%蔗糖偏愛百分比在應激第 14、21 天均低于對照組（t14=-3.922，P＜0.05；t21=-2.870；P＜0.05），見圖1。模型組蔗糖消耗量與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（F組間=2.345，P＜0.05；F組內(nèi)=72.802，P＜0.05；F交叉=3.669，P＜0.05），進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：在應激14 d 模型組蔗糖水消耗量、液體總消耗量均低于對照子鼠組（t14蔗糖消耗量=-4.025，P＜0.05；t14液體總消耗量=-2.484，P＜0.05）。

OFT 結(jié)果經(jīng)重復測量方差分析，組間比較發(fā)現(xiàn)，模型組水平運動得分與對照組差異有統(tǒng)計學意義（F組間=4.368，P＜0.05；F組內(nèi)=4.384，P＜0.05；F交叉=4.824，P＞0.05），模型組垂直運動得分與對照組存在差異（F組間=4.215，P＜0.05；F組內(nèi)=5.649，P＜0.05；F交叉=1.638，P＞0.05），進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，在應激第7、21、28 天模型組水平得分均低于對照組（t7=-4.018，P＜0.05；t21=-0，664，P＜0.05；t28=-2.444，P＜0.05），在應激第21 天模型組垂直運動得分低于對照組（t21=-2.447，P＜0.05），見圖1。

圖1 孕期慢性應激致母鼠行為學改變

2.3 孕期慢性應激對子代的影響

2.3.1 孕期慢性應激致子代體質(zhì)量降低 與對照子鼠組相比，模型子鼠組PND28、PND42 體質(zhì)量均低于對照子鼠組（P 均＜0.05），見表2。

2.3.2 孕期慢性應激致子代血漿皮質(zhì)酮濃度升高 模型子鼠組的血漿皮質(zhì)酮濃度與對照子鼠組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在PND28 和PND42時，模型子鼠組的血漿皮質(zhì)酮水平均高于對照子鼠組（P 均＜0.05），見表2。

表2 孕期慢性應激對子代體質(zhì)量和血漿皮質(zhì)酮的影響（±s）

表2 孕期慢性應激對子代體質(zhì)量和血漿皮質(zhì)酮的影響（±s）

組別n體質(zhì)量/g血漿皮質(zhì)酮/（ng·mL-1）PND28PND42PND28PND42對照子鼠組1697.29±26.87195.23±25.84413.91±53.86277.53±91.12模型子鼠組1675.69±19.26175.59±19.45504.11±132.72415.30±150.47 t 值-2.429-2.6142.5193.133 P 值0.0140.0210.0200.004

2.3.3 孕期慢性應激致子代焦慮、抑郁樣行為 模型子鼠組的水平運動得分低于對照子鼠組（P＜0.05），表明模型子鼠組較對照子鼠組的探究行為減少，處于緊張狀態(tài)。模型子鼠組的糖水消耗量、液體總消耗量和1%蔗糖偏愛百分比均低于對照子鼠組（P 均＜0.05）。模型子鼠組與對照子鼠組的靜止時間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型子鼠組靜止時間長于對照子鼠組，表明模型子鼠組處于失望、抑郁狀態(tài)，見表3。

表3 孕期慢性應激致子鼠行為學改變（±s）

表3 孕期慢性應激致子鼠行為學改變（±s）

組別nOFT/分SPTTST水平運動垂直運動 蔗糖水消耗/mL 液體總消耗/mL 1%蔗糖偏愛百分比/%靜止時間/s對照子鼠組 16 67.54±17.16 13.67±5.128.14±1.7113.21±1.7160.75±7.1752.17±38.94模型子鼠組 16 49.58±27.34 9.79±6.756.55±1.6011.73±1.7039.36±19.8998.03±56.22 t 值-2.225-1.829-2.704-2.444-4.0472.791 P 值0.0340.0770.0110.021＜0.0010.009

2.4 孕期慢性應激對子代胎盤GC 屏障相關(guān)蛋白表達的影響

子鼠胎盤組織Western blot 條帶圖結(jié)果顯示：模型子鼠組胎盤組織GC 相關(guān)蛋白11β-HSD2、P-gp 的相對表達均低于對照子鼠組（t=2.485，P ＜0.05；t=2.420，P ＜0.05），NR3C1 的相對表達高于對照子鼠組（t=2.240，P＜0.05），見圖2。

圖2 胎盤GC 屏障相關(guān)蛋白變化

2.5 子鼠情緒損傷與GC 屏障相關(guān)蛋白的相對表達的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，子鼠胎盤GC 屏障相關(guān)蛋白11β-HSD2、P-gp 的相對表達與OFT 的水平運動得分均呈正相關(guān)（P 均＜0.05），與SPT 的蔗糖水消耗、1%蔗糖偏愛百分比均呈正相關(guān)（P 均＜0.05），與TST 的靜止時間呈負相關(guān)（P＜0.05）；子鼠胎盤GC 屏障相關(guān)蛋白NR3C1 的相對表達與OFT 水平運動、垂直運動得分均呈負相關(guān)（P 均＜0.05），與TST 的靜止時間呈正相關(guān)（P＜0.05），與SPT 蔗糖水消耗、1%蔗糖偏愛百分比均呈負相關(guān)（P 均＜0.05），見表4。

表4 子鼠情緒損傷與胎盤GC 屏障相關(guān)蛋白的相對表達相關(guān)性分析（r 值）

3 討論

本研究通過建立孕期慢性應激動物模型發(fā)現(xiàn)，模型組的血漿皮質(zhì)酮水平在應激第14、21、28 天均較高于對照組，與文獻[14]的研究結(jié)果相似，模型組母鼠的糖水偏愛度降低，曠場試驗的活動度和探索能力均降低，與以往的研究[15]結(jié)果相似，結(jié)果提示：模型組處于應激狀態(tài)。此次造模周期為28 d，在應激第7 天合籠，母鼠在孕期以及懷孕期間都接受應激刺激，在造模過程中發(fā)現(xiàn)，模型組和對照組在應激第7、14 天的血漿皮質(zhì)酮水平較應激前1 d 和應激第1 天均有降低趨勢，引起這一結(jié)果的原因可能是第7 天為雌雄合籠的第1 天，第14 天合籠結(jié)束，大鼠當時所處的狀態(tài)為懷孕初期和交配期，這一時期的激素水平不穩(wěn)，這一現(xiàn)象可作為后期研究的切入點進行深入研究。

研究[16]表明，孕期長期焦慮會增加低體質(zhì)量兒等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，在PND28、PND42 模型子鼠組的體質(zhì)量均低于同期對照子鼠組，與相關(guān)研究[17]結(jié)果一致，說明孕期慢性應激致子代體質(zhì)量偏低。本研究結(jié)果表明，在PND28、PND42 模型子鼠組血漿皮質(zhì)酮水平均高于對照子鼠組，有研究[18]提到，孕期受到應激刺激，會激活母親自身HPA 軸改變，產(chǎn)生大量的皮質(zhì)醇，致使子代的皮質(zhì)酮升高，影響子代的情緒、認知能力，表明孕期應激會使子代的血漿皮質(zhì)酮升高。

目前多采用OFT 來反映動物對新環(huán)境的恐懼、焦慮狀態(tài)[19]。本研究結(jié)果顯示，相對于對照子鼠組，模型子鼠組對于新鮮事物的探索行為和適應能力降低，與趙楓等[20]研究結(jié)果一致。SPT 是一種反映快感是否缺失的指標[12]，結(jié)果顯示，模型子鼠組的蔗糖水消耗和1%蔗糖偏好百分比均低于對照子鼠組，表明孕期慢性應激導致子代對幸福事件的反應能力下降，與Lu 等[21]研究結(jié)果一致。STT 是反映失望情緒較經(jīng)典的試驗方法[22]，結(jié)果顯示，孕期慢性應激會致使子代對被迫體位的反抗能力降低，表現(xiàn)出失望、抑郁狀態(tài)，與甄鳳亞等[23]研究結(jié)果類似。以上結(jié)果均表明孕期慢性應激可導致子鼠出現(xiàn)焦慮、抑郁情緒。

母體GC 進入胎盤和胎兒是通過胎盤GC 屏障調(diào)控的，胎盤組織中11β-HSD2、P-gp 和NR3C1 含量豐富，且與胎盤GC 屏障的開放有密切關(guān)系[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型子鼠組胎盤GC 屏障關(guān)鍵基因11β-HSD2 相對表達下調(diào)，表明被代謝滅活的GC 含量減少，與相關(guān)研究[26]結(jié)果相似；P-gp 的相對表達下調(diào)，表明從胎兒面外將GC 排至母體面的量減少，與以往的研究[27]一致。蛋白NR3C1 的相對表達上調(diào)，表明與GC 受體NR3C1結(jié)合的GC 含量增加，與相關(guān)研究[28]結(jié)果相似。以上結(jié)果均表明，模型子鼠組暴露于高皮質(zhì)酮水平。結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果，孕期慢性應激子鼠情緒損傷與胎盤GC 屏障相關(guān)蛋白11β-HSD2、Pgp 的相對表達下降，NR3C1 的相對表達升高有關(guān)。正如孕期慢性應激引起機體HPA 軸持續(xù)激活，致使母體產(chǎn)生大量的GC，引起胎盤GC 屏障改變，影響胎兒的HPA 軸，進而影響胎兒情緒、認知等方面[29-30]。

綜上所述，孕期慢性應激導致子鼠出現(xiàn)焦慮、抑郁情緒，其機制可能與胎盤GC 屏障關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因11β-HSD2、P-gp 和NR3C1 的異常表達有關(guān)。近些年，孕期母體的焦慮引起胎盤GC屏障相關(guān)基因DNA 甲基化程度異常，并在出生后長期存在，最終造成胎兒HPA 軸功能失調(diào)及出生后神經(jīng)行為異常的研究逐漸增多，因此，接下來我們將進一步確定胎盤GC 屏障相關(guān)基因的異常甲基化，以及甲基化終生GC 反應和HPA 軸失調(diào)致認知發(fā)育損傷的機制，這對于探究成年疾病的胎兒起源和尋找阻斷胎盤GC 屏障改變的分子靶標，具有重要的理論和實踐意義。