PIP 對缺血性腦卒中大鼠皮質(zhì)和海馬Atg5、Atg14 自噬蛋白以及神經(jīng)功能的影響

楊 妙， 張義偉， 原茜倩， 呂昊文， 陳飛飛， 楊建榮， 平洪璐， 劉 娟，3

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)顱腦疾病重點實驗室，銀川 750004）

腦梗死又稱缺血性腦卒中，是由短暫或永久性的腦血管閉塞引起的局部供血減少或局部血栓形成[1]。盡管近年來缺血性腦卒中的臨床治療取得了進(jìn)展，但該疾病仍然是導(dǎo)致全球老年人死亡或致殘的主要原因[2]。黑胡椒是世界上最受歡迎的香料之一，屬于胡椒科植物[3]。黑胡椒具有辛辣刺激的味道歸因于含有2.0%～7.4%的胡椒堿（piperine，PIP），PIP 是其主要生物活性成分[4]。已發(fā)現(xiàn)PIP 具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗炎等特性[5]。并且該生物堿可抑制腦卒中后的炎癥反應(yīng)[6]以及凋亡[7]，但其對缺血性腦卒中的保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

自噬的激活在一些慢性神經(jīng)退行性疾病中具有保護(hù)作用，但在急性神經(jīng)疾?。ㄈ缒X缺血性損傷）中則是有害的，因為它可以導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[8]。因此，對自噬的干預(yù)顯得尤為重要。本研究使用大鼠永久性大腦中動脈閉塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）模型，觀察PIP 對缺血性卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)和自噬的影響，以期為開發(fā)治療缺血性腦卒中的新藥提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）成年雄性Sprague-Dawley 大鼠（260～330 g）購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［許可證號：SCXK（寧）2015-0001；倫理編號：2018-011］。PIP 購自上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司（≥98%，規(guī)格：5 g），避光保存。全蛋白檢測試劑盒、BCA 蛋白含量檢測試劑盒和SDS-PAGE 快速凝膠配制試劑盒購自凱基生物公司。自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene）Atg14 購自bioworld 公司，Atg5、β-actin 購自Cell Signaling Technology 公司。辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗購自北京天根公司，ECL 顯影試劑購自凱基生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 30 只SD 雄性大鼠分為5 組：假手術(shù)組、模型組、10 mg·kg-1PIP 干預(yù)組、20 mg·kg-1PIP 干預(yù)組以及30 mg·kg-1PIP 干預(yù)組，每組6 只。

1.2.2 pMCAO 模型 術(shù)前禁食12 h，腹腔注射7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）。將大鼠麻醉后置于仰臥位。沿頸部中部縱向切開皮膚，鈍性分離肌肉組織。暴露并分離右側(cè)頸總動脈（common carotidartery，CCA）、頸外動脈（externalcarotid artery，ECA）和頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）。ECA 和CCA 的近端用縫線小心地結(jié)扎。在CCA的遠(yuǎn)端做一個V 形切口，通過切口將光滑的26號尼龍線（1.7～1.8 cm）插入ICA 中，并結(jié)扎右側(cè)CCA 的遠(yuǎn)端。肌肉皮膚逐層縫合，然后用醫(yī)用酒精消毒。在整個手術(shù)過程中，大鼠用保溫毯保持在37 ℃。大鼠醒來后進(jìn)行Zea Longa 評分，得分為2 分的大鼠（可以觀察到大鼠不斷向左側(cè)轉(zhuǎn)圈行走）為成功的模型，被納入實驗，得分為0、1、3、4 分的大鼠被剔除。假手術(shù)組進(jìn)行類似手術(shù)，但僅在CCA 的遠(yuǎn)端V 形切口處將尼龍線插入ICA 中約5 mm，未阻塞大腦中動脈。

1.2.3 配制方法 實驗前將1、2、3 mg PIP 分別溶于1 mL 的5%羧甲基纖維素鈉中，配置成1、2、3 mg·mL-1濃度的PIP 溶液，并換算成10、20、30 mg·kg-1（PIP 無毒劑量根據(jù)文獻(xiàn)[9]確定）的給藥濃度。假手術(shù)組和模型組給予0.9%生理鹽水（1 mL/100 g），干預(yù)組給予PIP（1 mL/100 g），所有大鼠在缺血損傷后每天灌胃一次，連續(xù)14 d。

1.2.4 TTC 染色法檢測大鼠大腦梗死面積 在第15 天將大鼠處死，取腦組織在-20 ℃冷凍15 min后作冠狀切片。腦切片在2%TTC 中，37 ℃避光染色30 min。正常組織被染成紅色，而梗塞區(qū)域被染成蒼白色。使用Image J 測量梗塞面積。

1.2.5 Zea Longa 神經(jīng)功能評分 納入實驗的大鼠分別在缺血損傷第3、6、9、12、14 天進(jìn)行神經(jīng)功能評分：0 分，正常（無神經(jīng)功能損傷）；1 分，提尾時對側(cè)前肢內(nèi)收屈曲（輕度神經(jīng)損傷）；2 分，不斷向?qū)?cè)轉(zhuǎn)動（中度神經(jīng)損傷）；3 分，不斷向?qū)?cè)傾倒（重度神經(jīng)損傷）；4 分，無法自主行走并伴意識障礙或死亡。

1.2.6 Western blot 檢測各組大鼠海馬和皮層自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平 每組取3 只大鼠，共15 只。在第15 天將大鼠處死，快速剝離腦組織并取出海馬和皮層，用全蛋白提取試劑盒提取各組蛋白，BCA蛋白定量后每組取30 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)至PVDF膜、5%脫脂牛奶封閉2 h、一抗（Atg5、Atg14 以及β-actin 以1∶1 000 比例稀釋）4 ℃孵育過夜、二抗（以1∶20 000 比例稀釋）孵育（1 h）及曝光等步驟，結(jié)果用Image J 進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One－way ANOVA），兩兩比較采用LSD－t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PIP 對缺血性腦卒中梗死面積的影響

TTC 染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組梗死面積增加（P＜0.01）。與模型組相比，10、20、30 mg·kg-1PIP 干預(yù)組梗死面積均減小（P 均＜0.01），見圖1。

圖1 PIP 對缺血性腦卒中梗死面積的影響

2.2 PIP 對缺血性腦卒中神經(jīng)功能的影響

Zea Longa 神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示，第3、6、9、12、14 天與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)功能評分均升高（P 均＜0.01），證實模型成功。缺血損傷第12 天，與模型組相比，20 mg·kg-1和30 mg·kg-1PIP 干預(yù)組大鼠神經(jīng)功能評分均下降（P 均＜0.05）。缺血損傷第14 天，與模型組相比，10、20、30 mg·kg-1PIP 干預(yù)組大鼠神經(jīng)功能評分均下降（P 均＜0.05），見圖2。

圖2 PIP 對缺血性腦卒中神經(jīng)功能的影響

2.3 PIP 對腦缺血引起海馬損傷的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組Atg5 以及Atg14 的蛋白表達(dá)量上調(diào)（P 均＜0.05）。與模型組相比，20 mg·kg-1和30 mg·kg-1PIP 干預(yù)組Atg5 蛋白表達(dá)量下調(diào)（P 均＜0.05）。與模型組相比，10、20、30 mg·kg-1PIP 干預(yù)組Atg14 蛋白表達(dá)量均下調(diào)（P 均＜0.05），見圖3。

圖3 Western blot 檢測海馬自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量

2.4 PIP 對腦缺血引起皮質(zhì)損傷的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組Atg5 和Atg14 的蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（P 均＜0.05）。與模型組相比，30 mg·kg-1PIP 濃度劑量的Atg5 蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。與模型組相比，20 mg·kg-1和30 mg·kg-1PIP 干預(yù)組Atg14 蛋白表達(dá)水平均下調(diào)（P 均＜0.05），見圖4。

圖4 Western blot 檢測皮質(zhì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量

3 討論

自噬是細(xì)胞受到刺激后，通過溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的統(tǒng)稱，自噬的發(fā)生取決于不同功能復(fù)合物之間的相互作用，這些復(fù)合物由幾個不同的Atg 組成[10-11]。癲癇、阿爾茨海默病、腦缺血損傷等疾病的發(fā)生均與自噬相關(guān)[12-14]。缺血性腦卒中是由短暫或永久性的腦血管閉塞引起的腦損傷。有研究[15-16]報道，腦缺血損傷后腦區(qū)的自噬水平明顯升高，而缺血性腦損傷后Atg5 和Atg14自噬相關(guān)蛋白水平升高[17-18]。本研究證實了這一結(jié)果，pMCAO 模型組大腦皮質(zhì)的Atg5 和Atg14自噬蛋白表達(dá)量均升高，而實驗組給予PIP 干預(yù)后Atg5 和Atg14 自噬蛋白表達(dá)量均下降，尤其是30 mg·kg-1PIP 干預(yù)組可抑制缺血性腦卒中14 d 后Atg5 和Atg14 自噬蛋白的表達(dá)。Rudolph 等[19]研究報道，成人神經(jīng)發(fā)生失調(diào)的可能與中風(fēng)損傷后的認(rèn)知能力下降有關(guān)，而多數(shù)的研究集中在疾病對大腦皮層的影響，缺乏對海馬研究的相關(guān)報道[20]。鑒于此，本研究對海馬的Atg5 和Atg14 自噬蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析，實驗結(jié)果顯示，pMCAO模型組海馬的Atg5 和Atg14 自噬蛋白表達(dá)量也升高，實驗組中給予PIP 干預(yù)后Atg5 和Atg14 自噬蛋白表達(dá)量均下降，與大腦皮質(zhì)自噬蛋白表達(dá)趨勢一致。大腦皮質(zhì)和海馬的實驗結(jié)果顯示，給予PIP 干預(yù)后對缺血性腦卒中引起的過度自噬具有抑制作用。Zea Longa 神經(jīng)功能評分各PIP 干預(yù)組與模型組前6 d 相近，隨著PIP 干預(yù)時間的延長，Zea Longa 神經(jīng)功能評分逐漸下降，第14 天TTC染色PIP 干預(yù)組腦梗死面積縮小，尤其30 mg·kg-1PIP 干預(yù)組更為明顯，說明給予PIP 干預(yù)后對亞急性期缺血性腦卒中發(fā)揮保護(hù)作用。綜合以上實驗結(jié)果，缺血性腦卒中大鼠給予PIP 干預(yù)后可以降低海馬和皮質(zhì)Atg5 和Atg4 自噬蛋白的表達(dá)，而Atg5 和Atg14 自噬蛋白對缺血性腦卒中保護(hù)作用的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，需后續(xù)實驗進(jìn)一步探討。