結直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與程序性死亡配體1 表達的臨床意義

侯少華， 齊立溫， 紀小紅， 唐超峰， 李 海

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，銀川 750004）

根據(jù)全球癌癥流行病學的數(shù)據(jù)庫（GLOBOCAN）2020 年數(shù)據(jù)顯示[1]，結直腸癌發(fā)病率、死亡率均居前三位，嚴重危害人類健康。近年來免疫治療在特定患者人群中表現(xiàn)出顯著的療效。2015 年Le 等[2]首次發(fā)現(xiàn)了具有錯配修復缺陷（dMMR）或高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）分子的表型轉移性結直腸癌（mCRC）能從免疫檢查點抑制劑程序性死亡配體1（PD-L1）單抗（Pembrolizumab）免疫治療中顯著獲益。因此，本研究主要研究結直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）與PD-L1表達的臨床病理特征和相關臨床意義，并分析PCR檢測MSI 與IHC 檢測MMR 兩種方法結果的一致性，并進一步細分MSI-H 類型突變位點的多少及突變率，探索能否富集/篩選優(yōu)勢人群[3]，以期為PD-L1 單抗在結直腸癌個體化精準治療的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2019—2020 年在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院接受結直腸癌切除術、術后病理確診為結直腸癌的患者116 例作為研究對象，其中男性73 例，女性43 例；年齡25～80 歲，平均年齡57.4 歲；腫瘤部位：右半結腸24 例，左半結腸10 例，直腸82例；腫瘤類型：黏液腺癌11 例，其他腺癌103 例，印戒細胞癌2 例；pTNM 分期：Ⅰ期16 例，Ⅱ期53例，Ⅲ期47 例，病理分期按AJCC 結直腸癌第8版TNM 分期標準；腫塊直徑：≤5 cm 者76 例，>5 cm 者40 例；有神經(jīng)侵犯38 例，無神經(jīng)侵犯78例；有脈管癌栓38 例，無脈管癌栓78例；有淋巴結轉移49 例，無淋巴結轉移67 例。本課題得到寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會批準（KYLL-2021-1086），患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 多重PCR 檢測結直腸癌組織中MSI 位點

行結直腸癌手術的116 例患者中96 例送迪安公司檢測MSI，檢測位點包括6 個微衛(wèi)星位點（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27）。采用多重PCR 方法對6 個微衛(wèi)星位點進行擴增來確定MSI，判讀單核苷酸重復標志物中沒有發(fā)生改變?yōu)镸SI 穩(wěn)定型（MSS）；單核苷酸重復標志物中僅有1 個發(fā)生改變?yōu)镸SI 低頻型（MSI-L）；單核苷酸重復標志物中有≥2 個發(fā)生改變?yōu)镸SI 高頻型（MSI-H）。

1.3 免疫組化檢測結直腸癌組織中PD-L1 的表達

將結直腸癌患者行手術切除的新鮮腫瘤組織送迪安公司檢測PD-L1，共83 例，采用免疫組化（IHC）方法進行檢測。判讀標準：腫瘤細胞膜中PD-L1 染色比例。陰性（0），無著色；弱陽性（+），任何比例的細胞呈現(xiàn)微弱、不完整膜著色；陽性（++），＞10%的細胞呈現(xiàn)弱至中等強度、完整但不均勻膜棕黃著色；強陽性（+++），＞30%的細胞呈現(xiàn)強、完整膜棕褐著色。

1.4 免疫組化檢測結直腸癌組織中MMR 蛋白表達

將結直腸癌患者行手術切除的新鮮腫瘤組織送寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科檢測，通過IHC方法分別采用針對MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2的特異性抗體，免疫組織化學切片由病理科醫(yī)師閱片判讀，陽性表達定位于細胞核，如果腫瘤樣本中4 個MMR 蛋白均陽性表達，則為MMR 功能完整（pMMR）；4 個MMR 蛋白中任何一個不表達，即為MMR 蛋白缺失（dMMR）。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2或Fisher確切概率法。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。采用Kappa 分析免疫組化檢測MMR 蛋白和PCR 的毛細管電泳法檢測MSI 的一致性。

2 結果

2.1 結直腸癌患者腫瘤組織中MSI 檢測結果

在96 例腫瘤組織標本中，MSI-H 有13 例，發(fā)生率為13.5%（13/96）；MSI-L 有4 例，發(fā)生率為4.2%（4/96）；MSS 有79 例，發(fā)生率為82.3%（79/96）。13 例MSI-H 存在NR-21 位點改變的有8 例，突變率占61.5%（8/13），NR-27 位點改變的有13例，突變率占100%（13/13），NR-24 位點改變的有3 例，突變率占23.1%（3/13），BAT-26 位點改變的有10 例，突變率占76.9%（10/13），BAT-25 位點改變的有7 例，突變率占53.8%（7/13），MONO-27 位點改變的有0 例，突變率占0%（0/13）。

2.2 MSI 與結直腸癌臨床病理特征的相關性

結果顯示，MSI-L/MSS 與MSI-H 的結直腸癌患者之間腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度間差異均有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05），而浸潤深度、pTNM 分期、有無神經(jīng)或脈管侵犯、有無淋巴結轉移兩者間差異均無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05），見表1。

表1 結直腸癌患者MSI 與臨床病理特征的關系

2.3 結直腸癌患者腫瘤組織MSI 基因檢測與MMR 免疫組化結果一致性分析

在96 例結直腸癌腫瘤組織標本中，基因檢測結果MSI-H 的有13 例，MSI-L/MSS 的有83 例。免疫組化檢測結果dMMR 的有20 例，其中MLH1和PMS2 雙突變8 例，MSH2 和MSH6 雙突變3例，PMS2/MSH6/MLH1 單突變9 例；pMMR 的有76 例。兩者經(jīng)Kappa 一致性檢驗，結果一致性較好（Kappa=0.674），見表2。

表2 結直腸癌患者腫瘤組織MSI 基因檢測與MMR免疫組化結果一致性分析

2.4 結直腸癌患者腫瘤組織中PD-L1 的表達

在83 例腫瘤組織標本中，PD-L1 陽性表達率為42.2%，其中弱陽性（+）10 例，陽性（++）1 例，強陽性（+++）24 例，陰性表達率為57.8%，見圖1。

圖1 PD-L1 在結直腸癌患者腫瘤組織中的表達（免疫組化染色×400）

2.5 結直腸癌患者腫瘤組織中PD-L1 表達與臨床病理特征的關系

結直腸癌患者PD-L1 表達在性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、pTNM分期、有無神經(jīng)或脈管侵犯、有無淋巴結轉移之間差異均無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05），見表3。

表3 結直腸癌患者腫瘤組織中PD-L1 表達與臨床病理特征的關系

2.6 PD-L1 在MSS/MSI-L 和MSI-H 的結直腸癌患者腫瘤組織中的表達

既行MSI 檢測又行PD-L1 檢測共63 例，其中PD-L1 在MSI-L/MSS 的結直腸癌患者腫瘤組織中的陽性率（28.3%）低于MSI-H 的結直腸癌患者（70.0%）（P＜0.05），見表4。

表4 PD-L1在MSS/MSI-L 和MSI-H 的結直腸癌中的表達

3 討論

2017 年，NCCN 指南首次將免疫檢查點抑制劑PD-1 單抗Pembrolizumab 和Nivolumab 推薦用于具有dMMR/MSI-H 分子表型的mCRC 的末線治療[4]，免疫治療也成為繼外科手術、放化療之后又一種重要的治療方法。因此識別dMMR/MSI-H 結直腸癌和研究MSI 與PD-L1 表達的關系具有重要的臨床意義。

結腸基于胚胎發(fā)育、血液供應、解剖和功能等的差異，可將其分為右半結腸（盲腸、升結腸和橫結腸右半部）和左半結腸（橫結腸左半部、降結腸和乙狀結腸）[5]。本研究結果顯示，MSI-H 表型結直腸癌患者具有明顯且獨特的臨床病理特征：即位于右半結腸、腫瘤直徑較大、分化程度主要為中分化，這可能與右半結腸生物學特點有關，且與大多數(shù)文獻所報道的結果相一致[6-7]。MSI 基因檢測雖然作為dMMR 篩選的“金標準”，但復雜的程序和昂貴的成本難以在臨床篩查中普遍實施，特別是在經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)。因此，本文分別通過IHC 法檢測MMR 蛋白和PCR 法檢測MSI，并對檢測結果進行了統(tǒng)計分析。兩種檢測方法經(jīng)Kappa 一致性檢驗，結果一致性較好。這與國內外相關報道[8]的結果相吻合，可為IHC檢測MMR 蛋白作為一種初篩手段提供理論依據(jù)。Luchini 等[9]報道，PMS2 和MSH6 分別與MLH1和MSH2 協(xié)同，其表達非常依賴與伴侶蛋白的結合情況，即MLH1 表達缺失通常伴有PMS2 表達缺失，而MSH2 表達缺失通常伴有MSH6 表達缺失[10]。本研究很好地證實了這一點，經(jīng)過統(tǒng)計，MMR缺失的類型以MLH1 和PMS2 雙突變?yōu)橹?，其次為PMS2/MSH6 單突變。同時我們也發(fā)現(xiàn)了在9例PMS2/MSH6 單突變中，雖然蛋白表達缺失，IHC表現(xiàn)為dMMR，而PCR 卻顯示MSS 的有6 例。建議IHC 表現(xiàn)為dMMR 的PMS2/MSH6 單突變的患者可行PCR 復檢。

PD-L1 信號通路是一種負反饋系統(tǒng)[11-12]，腫瘤部位的微環(huán)境可誘導腫瘤細胞的PD-L1 表達，從而利于腫瘤的發(fā)生和生長，誘導抗腫瘤T細胞的凋亡。Xiao 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在MSI 腫瘤的微環(huán)境中存在免疫檢查點相關蛋白的顯著表達[14]。根據(jù)非小細胞肺癌的臨床實驗結果，如果腫瘤組織以及腫瘤周圍組織的PD-L1 表達率＞1%，使用PD-1 抗體的療效就會明顯增加，如果PD-L1 的表達率超過50%，預示PD-1 抗體的療效會很顯著。在本研究中，MSI-H 的結直腸癌患者癌組織中PD-L1 呈高表達，這與有些研究[15-16]成果一致，且證實了LE 等的研究結果。即具有dMMR 或MSI-H 分子表型mCRC 可能從PD-L1免疫抑制劑治療中顯著獲益，且MSI-H分子表型可以作為免疫檢查點抑制劑（ICI）的陽性預測標志物。此外，PD-L1 表達在結直腸癌患者性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、浸潤深度、TNM 分期、有無神經(jīng)或脈管侵犯、有無淋巴結轉移之間差異無統(tǒng)計學意義。饒雄輝等[17]的Meta 分析顯示，PD-L1 表達與淋巴結轉移、腫瘤分化程度有關。在本研究中，未能得到相同的結論，造成這種差異的原因，可能是入組病例數(shù)少有關。

為探索能否進一步富集優(yōu)勢人群，本研究分析了MSI-L 的基因突變位點的多少及突變率，結果在MSI-H 表型的結直腸癌中，NR-27 突變率最高，其次為NR-21 和BAT-26，MONO-27 最低，推測患者在對免疫抑制劑長效治療中可能與基因突變的多少及突變率有關，此類相關報道較少，有待進一步進行相關的臨床研究。

綜上所述，本研究證實了在MSI-H 的結直腸癌患者中PD-L1 陽性率高于MSI-L 及MSS 的結直腸癌，MSI-H 分子表型可以作為免疫檢查點抑制劑（ICI）的陽性預測標志物。并且IHC 和PCR兩種檢測結果的一致性較好，可以根據(jù)情況，選用適當且經(jīng)濟的檢測方法。MSI-H 基因常見突變點為NR-27、NR-21 和BAT-26，可以為PD-L1 在結直腸癌個體化精準治療的臨床應用提供理論依據(jù)。