維生素 K 1聯(lián)合 X射線對非小細胞肺癌細胞存活能力的影響

司少艷，秦亞亞，王宗燁，宋淑軍#

戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心1綜合基礎(chǔ)研究室，2放療科，北京 100101

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肺癌新發(fā)病例220萬，僅次于乳腺癌，死亡病例180萬，居惡性腫瘤死亡例數(shù)第一；2020年中國肺癌新發(fā)病例和死亡病例均居惡性腫瘤首位，分別為82萬和71萬[1]。美國癌癥協(xié)會報道非小細胞肺癌占全部肺癌的80%～85%[2]。放療是肺癌的重要治療手段，特別是局部晚期非小細胞肺癌、轉(zhuǎn)移肺癌不能進行其他治療時，放療顯得尤為重要。然而，放療也存在一定的不良反應(yīng)，許多患者會逐漸產(chǎn)生放療抵抗或?qū)Ψ暖煵幻舾小Ｒ虼?，為了提高療效、減輕不良反應(yīng)或減少放療抵抗，開發(fā)一些與放療具有協(xié)同作用的藥物可能會減少不良反應(yīng)或增加放療敏感性，對改善腫瘤患者的臨床預(yù)后具有非常重要的意義。但大多數(shù)藥物存在不良反應(yīng)，因此近年來人們越來越關(guān)注無不良反應(yīng)的天然食品。維生素是維持人體正常功能所必需的營養(yǎng)素，在新陳代謝中發(fā)揮著重要作用。維生素K（vitamin K，VK）是一種脂溶性維生素，于1929年首次被發(fā)現(xiàn)[3]，是參與凝血過程的一種必需因子，天然形式的VK1和VK2及人工合成的VK3、VK4和VK5均含有2-甲基-1，4-萘醌環(huán)結(jié)構(gòu)[4]。VK1屬于天然營養(yǎng)素，主要存在于綠色蔬菜和植物中，又稱葉綠醌，是VK在食物中的主要存在形式，很少產(chǎn)生不良反應(yīng)，對多種人類腫瘤細胞表現(xiàn)出一定的抗腫瘤特性[4-5]，而且可以增強索拉非尼對結(jié)腸癌細胞的抑制作用[6]。目前有關(guān)VK1對腫瘤放療影響的研究尚未見報道，本研究探討VK1聯(lián)合X射線對非小細胞肺癌細胞存活能力的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細胞肺癌細胞A549由美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）提供，細胞培養(yǎng)基RPMI-1640購自美國GE醫(yī)療生命科學(xué)部，胎牛血清由上海依科賽生物制品有限公司提供，Axesse醫(yī)用電子直線加速器購自瑞典Elekta公司，瑞氏-姬姆薩染液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，VK1購自江蘇華陽制藥有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)應(yīng)用改良的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)基中含10%胎牛血清、青霉素（100 IU/ml）和鏈霉素（100 IU/ml），于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液1次，取對數(shù)生長期細胞進行傳代接種及后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞照射采用瑞典Elekta公司生產(chǎn)的Axesse醫(yī)用電子直線加速器，室溫下6MV-X射線照射細胞，照射源軸距為100 cm。照射劑量為2 Gy，劑量率為4 Gy/min。對照組細胞不進行實際照射，但同樣運至照射地點。

1.2.3 細胞集落形成實驗將對數(shù)生長期的A549細胞稀釋成單細胞懸液，然后接種于6孔板中，每孔400個細胞，待細胞貼壁后，換成含有0、6.25、12.50、25.00 μg/ml VK1的培養(yǎng)基處理細胞，分別作為對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組，1天后進行X射線照射（每個VK1劑量組均設(shè)未照射對照組），單次照射總劑量為2 Gy。然后把細胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，應(yīng)用含原相同濃度VK1的培養(yǎng)基每2～3天換液1次，藥物處理時間為8天，于照射后第8天（照射后7天整），應(yīng)用4%多聚甲醛固定細胞，然后應(yīng)用瑞氏-姬姆薩染液進行染色，顯微鏡下觀察細胞，對≥50個細胞的細胞團（集落）進行計數(shù)，集落形成效率=每孔集落數(shù)量/每孔接種細胞數(shù)量×100%，存活分數(shù)=實驗組集落數(shù)量（/該組每孔細胞接種數(shù)×未照射對照組集落形成效率）×100%。

1.2.4 藥物相互作用的評價根據(jù)Cohen等[7]的方法計算藥物相互作用系數(shù)（coefficient of drug interaction，CDI），計算公式：CDI=AB（/A×B），其中AB為VK1與射線聯(lián)合作用后細胞的存活率，A為單獨VK1處理后細胞的存活率，B為單獨射線作用后細胞的存活率。CDI=1時兩者為相加作用，CDI＞1時兩者為拮抗作用，CDI＜1時兩者為協(xié)同作用，CDI＜0.7時兩者為顯著的協(xié)同作用。但一般為了補償生物實驗的自然偏差，相加作用的判斷可擴展至0.9≤CDI≤1.1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。繪制劑量-反應(yīng)曲線，計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VK 1對 A549細胞集落形成能力的影響

不同濃度VK1處理后A549細胞集落數(shù)量明顯不同（圖1）。VK1高濃度組、中濃度組、低濃度組、對照組細胞集落數(shù)量分別為（50.0±8.7）、（158.7±5.2）、（201.0±3.8）、（188.7±3.4）個。其中高濃度組細胞集落數(shù)量最少，僅為對照組的26.5%，中濃度組次之，為對照組的84.1%，而低濃度組與對照組細胞集落數(shù)量無明顯差異。高濃度組細胞集落數(shù)量低于中濃度組、低濃度組、對照組，且中濃度組細胞集落數(shù)量低于對照組和低濃度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。VK1能夠使A549細胞集落數(shù)量減少，且呈劑量依賴性，IC50為20.22 μg/ml。

圖1 不同濃度VK 1處理后 A549細胞集落數(shù)量

2.2 VK 1與 X射線對 A549細胞存活分數(shù)的影響

對于未照射X射線的A549細胞，VK1中濃度組和高濃度組細胞存活分數(shù)均低于對照組和低濃度組，高濃度組細胞存活分數(shù)低于中濃度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對于照射X射線的A549細胞，低濃度組、中濃度組和高濃度組細胞存活分數(shù)均低于對照組，中濃度組和高濃度組細胞存活分數(shù)均低于低濃度組，高濃度組細胞存活分數(shù)低于中濃度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。照射X射線的各組細胞存活分數(shù)均低于未照射X射線的各組細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。X射線（2 Gy）照射后A549細胞集落數(shù)量明顯減少，在對照組中，與未照射X射線的細胞比較，照射X射線的細胞存活分數(shù)下降了44.5%；低濃度、中濃度和高濃度VK1與X射線聯(lián)合作用后細胞存活分數(shù)較單獨X射線照射分別下降了39.5%、72.1%和98.1%，較未照射X射線的對照組分別下降了66.4%、84.5%和98.9%，其下降程度與VK1濃度呈劑量依賴性。與未進行X射線處理的細胞比較，低濃度、中濃度和高濃度VK1與X射線聯(lián)合作用后細胞存活分數(shù)分別下降了68.5%、71.5%和96.0%，其下降程度與VK1濃度呈劑量依賴性。（表1）

表1 VK 1與 X射線對 A549細胞存活分數(shù)的影響

2.3 不同濃度VK 1與 X射線聯(lián)合作用的CDI

低濃度、中濃度、高濃度VK1與X射線聯(lián)合作用的CDI分別為0.57、0.33和0.07，均明顯小于0.7。

3 討論

體外集落或克隆形成實驗于60多年前由Puck和Marcus[8]建立，是檢測單個細胞在體外增殖并形成細胞群體（50及以上的細胞團稱為一個集落）的能力，該技術(shù)是評價腫瘤細胞存活和增殖能力的良好方法[9]，可以用來評估各種治療方法的細胞毒性效應(yīng)，被廣泛用于檢測化學(xué)藥物或輻射對腫瘤細胞的抑制效果[10-11]，與其他體外生物活性實驗相比，集落形成實驗更為敏感[12]。已有研究證明，集落形成實驗結(jié)果與臨床藥物的實際反應(yīng)具有一定的相關(guān)性[13]。本研究應(yīng)用體外集落形成實驗評估VK1與X射線對非小細胞肺癌細胞A549存活能力的影響。

VK屬于脂溶性維生素，通常被認為是血液凝固的關(guān)鍵因素，近年來在體內(nèi)試驗和體外實驗中均觀察到各種VK的抗腫瘤作用。動物實驗結(jié)果顯示，給荷肝癌大鼠腹腔內(nèi)注射VK3，每周1次，每次10 mg，持續(xù)給藥4周，其存活期從對照組的17天延長至治療組的60天[14]。研究者對皮下肉瘤模型小鼠進行VK2治療，結(jié)果顯示，靜脈或灌胃兩種給藥方式均可顯著抑制腫瘤生長[15]。在臨床試驗中，晚期肝癌患者服用VK3后，17%的患者腫瘤體積縮小，而且患者的平均生存時間也有所增加[16]。在一項24 000多人參與的調(diào)查研究中，通過10年以上的隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，VK2能夠在一定程度上降低惡性腫瘤病死率，膳食VK2攝入量與男性肺癌和前列腺癌的發(fā)生風(fēng)險呈顯著負相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)其與VK1的攝入量具有相關(guān)性[17]。然而對美國人群的一項調(diào)查研究并未發(fā)現(xiàn)食物中VK（VK1、VK2和總VK）的攝入量與全部前列腺癌或晚期前列腺癌的發(fā)生有關(guān)[18]。一項10萬多人參與的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，飲食中VK1和二氫VK1的攝入量與胰腺癌的發(fā)生風(fēng)險呈負相關(guān)，而未發(fā)現(xiàn)VK2攝入量與胰腺癌具有相關(guān)性[19]。以上調(diào)查結(jié)果不一致可能與研究方式、地區(qū)、人種以及腫瘤類型不同有關(guān)。但多數(shù)的體外實驗顯示VK對多種類型的腫瘤細胞具有抗腫瘤特性[5，20]，VK3和 VK5能夠抑制白血病細胞增殖，誘導(dǎo)白血病細胞凋亡[21]。VK2對多種肺癌細胞系，包括小細胞癌、腺癌、鱗狀細胞癌以及大細胞癌的生長均具有劑量依賴性抑制作用，其抑制效果與肺癌細胞系的組織類型無關(guān)[22]。VK1可以誘導(dǎo)人類胃癌和結(jié)腸癌細胞凋亡并抑制細胞增殖，而且不同的腫瘤細胞對VK的敏感性不同，結(jié)腸癌細胞比胃癌細胞對VK1的反應(yīng)更明顯[23]。目前，有關(guān)VK1對非小細胞肺癌A549細胞的影響尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，VK1呈劑量依賴性抑制A549細胞集落形成，高濃度VK1（25.00 μg/ml）單獨處理細胞即可以抑制近75%的細胞集落形成，提示VK1在體外對A549細胞的生長及存活具有明顯的抑制作用。這為進一步研究VK1的抗腫瘤作用提供了依據(jù)。本研究中VK1對A549細胞的IC50為20.22 μg/ml（相當(dāng)于55.5 μmol/L），明顯小于以往報道的6～9 mmol/L[20]，造成這種差異的原因可能與采用的實驗方法不同有關(guān)，本研究中采用的集落形成實驗比其他細胞存活實驗更敏感[12]。而且研究的腫瘤細胞種類不同，不同的腫瘤細胞對VK1的敏感性不同。此外，藥物處理時間不同也會影響IC50，本研究中藥物處理時間為8天，細胞一直處于含有VK1的培養(yǎng)基中，因此，如果臨床應(yīng)用VK1協(xié)助治療腫瘤，在治療期間持續(xù)維持體內(nèi)VK的充足水平可能也是影響治療效果的重要因素。

VK1作為一種天然產(chǎn)物，具有一定的抗腫瘤活性，近年來研究顯示VK1與化療藥物索拉非尼聯(lián)合使用可以明顯增強索拉非尼對人類腫瘤細胞（如肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌以及惡性膠質(zhì)瘤細胞）的抗腫瘤作用，VK1可以增強化療藥物對腫瘤細胞存活、遷移、增殖的抑制作用以及對腫瘤細胞凋亡的促進作用[24]。因此，VK1有可能是放療增效作用的潛在制劑。本研究結(jié)果顯示，VK1可以呈劑量依賴性增強2 Gy照射對A549細胞存活的抑制作用，雖然低劑量VK1單獨處理對細胞的集落形成能力沒有抑制作用，但低劑量VK1與X射線聯(lián)合作用可以使X射線對細胞的抑制能力提高近40%，因此，VK1有可能成為放療潛在的增敏劑。而高劑量VK1的抑制作用明顯提高，較單獨照射組的抑制作用提高98%以上，接近1倍，說明VK1對X射線具有增效作用。而且兩者聯(lián)合使用較單獨使用的抑制效果更明顯，說明兩者可能具有協(xié)同作用。曾有研究報道，VK1與索拉非尼聯(lián)合使用對肝癌細胞的遷移和增殖具有協(xié)同抑制作用[25]。

兩種藥物或治療方法聯(lián)合使用時，其相互作用結(jié)果的判斷可以通過CDI進行評估[7]。CDI＜1時兩者為協(xié)同作用，CDI＜0.7時兩者為顯著的協(xié)同作用，本研究結(jié)果顯示，低濃度、中濃度、高濃度VK1與X射線聯(lián)合作用的CDI分別為0.57、0.33和0.07，均明顯小于0.7，說明VK1與X射線之間的相互作用為顯著的協(xié)同作用，而不是簡單的加性效應(yīng)。本研究為VK1和X射線聯(lián)合治療非小細胞肺癌提供了一定的實驗依據(jù)。在放射治療期間適當(dāng)補充VK1，使體內(nèi)VK1處于充足狀態(tài)，可能會增強放射治療對腫瘤細胞的殺傷效果。

綜上所述，VK1對非小細胞肺癌細胞具有劑量依賴性抑制作用，其與X射線聯(lián)合使用對非小細胞肺癌細胞具有協(xié)同抑制作用。然而，VK1增強X射線療效的機制目前還不清楚，本研究僅對A549細胞的集落形成能力進行了研究，VK1對腫瘤細胞其他生物學(xué)特性（如細胞周期、凋亡、自噬以及增殖）的影響同樣重要，也需要進行研究。此外，體外培養(yǎng)時細胞的增殖、生長以及生命力的體現(xiàn)均與體內(nèi)環(huán)境有明顯差異，因此，體內(nèi)試驗也有待進一步開展。