甲磺酸阿帕替尼治療腎透明細胞癌的實驗和臨床研究

張倩茹，劉建坤，王永欣，李鐵鋼，高冬梅，趙瑞景，朱鐵年

腎癌是常見泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。數(shù)據(jù)證實，抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可誘導(dǎo)腫瘤縮小并延長無進展生存期[2]。甲磺酸阿帕替尼可選擇性結(jié)合至受體細胞內(nèi)ATP結(jié)合域，從而抑制VEGFR-2介導(dǎo)血管生成。研究表明，甲磺酸阿帕替尼在治療多種實體瘤中療效顯著[3],但在腎癌方面研究少有報道，故本研究探討甲磺酸阿帕替尼對人腎癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用及其對CD34和Ki-67表達的影響，并評估其對晚期腎癌患者的療效及安全性。

1 材料與方法

1.1動物實驗

1.1.1藥物與試劑：實驗用甲磺酸阿帕替尼由江蘇恒瑞公司惠贈，用含0.5%羧甲基纖維素的生理鹽水溶液溶解，配制成不同濃度的藥物混懸液，用于灌胃治療。CD34單克隆抗體從福州邁新生物技術(shù)公司購買，Ki-67單克隆抗體從上海杰浩生物公司購買。

1.1.2細胞株及實驗動物：人腎透明細胞癌786-O細胞購自北京中源合聚生物科技公司。SPF級BALB/c雌性裸鼠24只，12～15 g，6～7周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[實驗動物許可證編號：SCXK(京)2016-0006],由解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)，動物房溫度控制在20～24 ℃，濕度為40%～60%，每2日更換墊料和飼料，動物可自由攝入滅菌處理水和飼料。

1.1.3荷瘤鼠模型的建立：將人腎透明細胞癌786-O細胞吸取至含有10%胎牛血清、青鏈霉素混合液RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，結(jié)合細胞生長狀態(tài)，隔日更換培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期786-O細胞，計數(shù)后調(diào)整細胞密度3×107個/ml，用1 ml注射器吸取0.2 ml細胞懸液，注射于每只裸鼠右側(cè)背部皮下。

1.1.4腫瘤生長情況：自786-O細胞注射于裸鼠皮下開始每日觀察接種部位,待腫瘤出現(xiàn)，測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積：V=1/2×長徑×短徑2。接種約5 d，待腫瘤生長至50～150 mm3，隨機分為4組，每組6只。對照組(生理鹽水組)及低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量甲磺酸阿帕替尼組，均給予灌胃治療，療程2周。灌胃期間，每日觀察荷瘤鼠的一般狀況及皮下移植瘤的生長狀態(tài)，末次給藥24 h后脫臼處死裸鼠，取出腫瘤組織稱瘤質(zhì)量，置于10%甲醛溶液供病理組織學檢查。

1.1.5CD34和Ki-67在不同組別裸鼠移植瘤組織的陽性表達：利用免疫組織化學法檢測血管內(nèi)皮細胞標志物CD34和增殖指標Ki-67的表達情況。用10%甲醛溶液固定組織24 h，常規(guī)脫水包埋，3 μm連續(xù)切片。滴加鼠單克隆抗體CD34及Ki-67，室溫下孵育，滴加羊抗鼠IgG過氧化物酶聚合物，室溫下孵育，DAB顯色、蘇木紫復(fù)染、脫水、透明、封片，中性樹膠和蓋玻片封片。低倍鏡下尋找移植瘤組織中陽性表達的最密集區(qū)，然后換高倍鏡下計數(shù)，每張組織切片選擇5個陽性表達最多的區(qū)域，并計算平均值。

1.2資料與方法

1.2.1臨床資料：收集河北省多家醫(yī)院2018年1月—2019年9月腎癌32例的臨床資料。納入標準：美國東部腫瘤協(xié)作組織(ECOG)評分≤2分；血常規(guī)、肝腎功能無明顯異常；無嚴重心臟疾病。排除標準：合并凝血功能障礙；胃腸疾??；精神病史；妊娠和哺乳期婦女。32例中男27例，女5例；年齡(55.31±8.95)歲；透明細胞癌25例，非透明細胞癌7例；ECOG評分為0～1分者26例，2分者6例；既往手術(shù)治療27例，未手術(shù)治療5例；遠處轉(zhuǎn)移器官數(shù)目<3處12例，3處及以上轉(zhuǎn)移者20例。

1.2.2治療方法：患者均接受甲磺酸阿帕替尼治療：對于腎原發(fā)病灶未切除、營養(yǎng)狀況或體質(zhì)較差的患者，適當降低起始劑量。其中23例起始劑量為250 mg/d，9例起始劑量為500 mg/d，餐后30 min口服，4周為1個周期，2個周期后評估療效。

1.2.3療效判定：據(jù)RECIST 1.1實體瘤療效評價標準[4]分為完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定、疾病進展。

1.2.4不良反應(yīng)及隨訪：采用CTCAE 5.0版標準評價不良反應(yīng)。隨訪截止日期為2019年11月。

2 結(jié)果

2.1不同劑量甲磺酸阿帕替尼對裸鼠移植瘤組織的抑制作用 治療2周后，甲磺酸阿帕替尼中、高劑量組裸鼠移植瘤組織體積、質(zhì)量均較對照組明顯減小(P<0.05)。甲磺酸阿帕替尼低、中、高劑量組抑瘤率分別為32.98%、48.35%、54.95%。見表1。

2.2甲磺酸阿帕替尼治療對腫瘤血管生成和增殖的影響 治療2周后，甲磺酸阿帕替尼中、高劑量組移植瘤組織Ki-67、CD34蛋白表達低于對照組(P<0.05)。見表2。

2.3甲磺酸阿帕替尼對晚期腎癌患者的療效和安全性 本組完全緩解0例，部分緩解9例，疾病穩(wěn)定17例，疾病進展6例，疾病控制率81.2%，客觀緩解率28.1%。常見的不良反應(yīng)中，高血壓6例，蛋白尿5例，手足綜合征1例，血小板下降2例，轉(zhuǎn)氨酶升高3例。3～4級不良反應(yīng)中高血壓5例、蛋白尿1例。

表1 4組荷瘤裸鼠移植瘤組織體積、質(zhì)量及抑瘤率比較

表2 4組荷瘤裸鼠移植瘤組織血管生成和細胞增殖相關(guān)蛋白表達情況

3 討論

VEGFR-2與其配體VEGF-A是新血管生成的基礎(chǔ)，血管生成也是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因。甲磺酸阿帕替尼可以與VEGFR-2特異性結(jié)合并抑制VEGFR-2及VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移和增殖，抑制腫瘤新生血管生成，從而減少腫瘤血供。本研究結(jié)果顯示，甲磺酸阿帕替尼中、高劑量組抑瘤效果顯著。有研究報道，甲磺酸阿帕替尼劑量依賴性地抑制了異種移植瘤模型的腫瘤生長[5]。有研究表明，相較于VEGFR-2低表達的肝癌移植瘤組織，甲磺酸阿帕替尼對VEGFR-2高表達的肝癌移植瘤組織的抑制作用更強[6]。此外，治療期間甲磺酸阿帕替尼各劑量組裸鼠體質(zhì)量未出現(xiàn)明顯波動，也未出現(xiàn)治療相關(guān)死亡，提示甲磺酸阿帕替尼治療腫瘤有效且耐受性良好。

研究表明，Ki-67和CD34的高表達與腫瘤的惡性生物學行為息息相關(guān)[7]。本研究結(jié)果顯示，甲磺酸阿帕替尼可降低腫瘤組織內(nèi)CD34和Ki-67的陽性表達，且有劑量依賴性。本研究結(jié)果顯示，32例腎癌治療后疾病控制率為81.2%，客觀緩解率為28.1%。有研究報道，對于既往接受過舒尼替尼治療的患者，阿昔替尼客觀緩解率高于索拉非尼[8]。本研究結(jié)果與文獻報道相比，甲磺酸阿帕替尼較阿昔替尼優(yōu)勢明顯。在METEOR試驗中，卡博替尼客觀緩解率高于依維莫司[9]。本結(jié)果與其相比，甲磺酸阿帕替尼優(yōu)于卡博替尼，考慮與入選患者人種及既往用藥相關(guān)。

本研究不良反應(yīng)發(fā)生率為53.1%，其中3～4級不良反應(yīng)主要為高血壓和蛋白尿。在METEOR研究中，卡博替尼3級以上不良反應(yīng)發(fā)生率遠高于甲磺酸阿帕替尼，此外在卡博替尼治療期間出現(xiàn)一例死亡事件。本研究不良反應(yīng)大部分為1～2級且可以控制，3級以上不良反應(yīng)可通過停藥或減量緩解癥狀，說明甲磺酸阿帕替尼具有較高的安全性。

綜上，甲磺酸阿帕替尼能有效抑制腎癌裸鼠移植瘤的生長，考慮與抑制腫瘤血管生成及增殖有關(guān)。同時臨床研究結(jié)果呈現(xiàn)出有效的抗腫瘤活性和可控的不良反應(yīng)，為轉(zhuǎn)移性腎透明細胞癌的治療提供依據(jù)。