核內不均一性核糖核蛋白H2抑制流感病毒復制機制初步研究

王苗利，薛瑞雪，張 月，藺曉月，李玉杰，邢林林，孔祥華，王貴升

（山東省動物疫病預防與控制中心，山東 濟南 250100）

流感病毒（Influenza virus）屬于正粘病毒科流感病毒屬，病毒結構由內而外分為核芯、基質蛋白和囊膜三個部分，基因組包含8個分節(jié)段的單股負鏈RNA（ss-RNA）。流感病毒的基因組RNA（vRNA）與核蛋白（NP）結合，并與RNA聚合酶復合體纏繞成致密的核糖核蛋白復合體（RNPs），以異源三聚復合體的形式存在于感染宿主的細胞核內，主要參與病毒RNA的合成。流感病毒感染的宿主范圍十分廣泛，包括人和其他哺乳動物、禽類、鳥類等。

不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）是細胞核內的一類RNA結合蛋白，包括約30個高豐度表達的成員，這類蛋白可與新合成的不均一性RNAs（hnRNAs/pre-mRNAs）的內含子區(qū)域結合來協(xié)助完成內含子的剪切，并在mRNA從細胞核轉運至細胞質的過程中結合mRNA來穩(wěn)定mRNA結構。

本研究前期發(fā)現(xiàn)hnRNP H2蛋白能夠抑制流感病毒復制，為進一步探究hnRNP H2是否會抑制流感病毒復制及相關機制，本研究采用雙熒光素酶活性試驗、免疫共沉淀試驗等方法進行相關研究分析。

1 材料與方法

表1 引物序列

1.1 病毒株、細胞及質粒毒株A/WSN/1933(H1N1)、293T細胞系、犬腎上皮細胞系MDCK由本試驗室保存；含有流感病毒聚合酶識別序列的螢火蟲熒光素酶報告基因質粒（LUC）和含有CMV啟動子序列的海腎螢光素酶報告基因質粒（RENILLA）由本實驗室構建；pCMV-N-Flag載體、pCAGGS載體購自Novagen公司。

1.2 主要試劑兔抗beta Actin、Flag、hnRNP H2多抗和鼠抗A型流感病毒NP、M1、M2、PB1、PB2、PA多抗均購自ThermoFisher公司；T7 RNA體外轉錄試劑盒均購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒和質粒提試劑盒購自QIAGEN公司；RIPA裂解液（弱）和SDS-PAGE凝膠配置試劑盒均購自碧云天生物技術公司；ECL發(fā)光液和Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自翊圣生物公司。

1.3 引物設計根據GenBank中登錄的hnRNP H2序列及流感病毒參考株的NP、PB1、PB2和PA序列，分別設計擴增引物。

1.4 利用雙熒光素酶報告基因試驗檢測hnRNP H2蛋白對流感病毒聚合酶的影響將LUC、RENILLA、pCAGGS-NP、pCAGGS-PB1、pCAGGS-PB2、pCAGGS-PA、pCMV-N-Flag-hnRNP H2（對 照 組pCMV-N-Flag）質粒共轉染293T細胞，轉染后30h，用Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒按照說明書裂解細胞，取部分裂解上清加入蛋白上樣緩沖液，95℃10 min變性處理后，用鼠抗NP、PB1、PB2、PA(1：1000)多抗和兔抗beta Actin、Flag(1：1000)多抗為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG(1：10000)、HRP標記的羊抗鼠IgG(1：10000)為二抗，利 用western blot檢 測NP、PB1、PB2、PA、hnRNP H2和beta Actin蛋白的表達水平。另取部分裂解上清于96孔板中，利用發(fā)光檢測儀檢測轉染pCMV-N-Flag-hnRNP H2以及pCMV-N-Flag空載體樣品的聚合酶活性。

1.5 利用免疫共沉淀試驗檢測hnRNP H2與流感病毒RNA相互作用分別將pCMV-N-Flag-hnRNP H2質粒和pCMV-N-Flag質粒轉染293T細胞，24h后接種MOI 0.1 A/WSN/1933，感染后30 h，棄去上清，用RIPA裂解液（弱）4℃條件下裂解10～20 min，收集細胞裂解液，離心獲得上清，上清液中加入Anti-DDDDK-tag mAb-Magnetic Agarosse磁珠，4℃搖床過夜。預冷的RIPA洗滌4次，離心棄上清。將磁珠分為兩部分：一部分用兔抗hnRNP H2(1：1000)多抗為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG(1：10000)為二抗，利用western blot檢測hnRNP H2蛋白的表達水平；另一部分提取RNA，RNA提取后分為兩部分，一部分用Oligo(dT)引物進行反轉錄，用WSN-PA-F1/R1引物檢測病毒mRNA水平，另一部分Uni 12引物進行反轉錄，用WSN-PA-F/R引物檢測病毒vRNA水平。

2 結果

2.1 hnRNP H2蛋白抑制流感病毒聚合酶活性Western blot結果顯示，轉染的質粒均可檢測到PB1、PB2、PA、NP和Flag-hnRNP H2蛋白（圖1A）。在此基礎上，過表達hnRNP H2蛋白后，流感病毒聚合酶活性顯著下降（圖1B）。表明hnRNP H2蛋白能夠在流感病毒轉錄復制階段發(fā)揮抑制作用。

圖1 hnRNP H2蛋白過表達對流感病毒聚合酶的影響

2.2 hnRNP H2蛋白能夠與流感病毒RNA發(fā)生相互作用在293T細胞上分別轉染pCMV-N-Flag-hnRNP H2質粒和pCMV-N-Flag質粒，轉染后12h，將A/WSN/1933以MOI 0.1感染細胞，細胞感染后24h，利用Anti-DDDDK-tag mAb-Magnetic Agarosse磁珠進行CO-IP，結果顯示，hnRNP H2蛋白共沉淀下來的流感病毒vRNA和mRNA均明顯多于對照組（圖2），說明hnRNP H2蛋白能夠與流感病毒RNA發(fā)生相互作用。

圖2 免疫共沉淀驗證hnRNP H2蛋白與RNA相互作用

3 討論

流感病毒在復制過程中，有大量的宿主蛋白參與其中，研究宿主蛋白與流感病毒之間的相互作用，能夠深入闡明流感病毒的復制及致病機制，為抗流感藥物的研發(fā)提供潛在靶標。流感病毒在細胞核內完成復制，核內一些蛋白蛋白會參與流感病毒復制，已有研究表明核內蛋白hnRNP K能夠與流感病毒NS1蛋白相互作用而參與流感病毒復制過程；Ecco等研究發(fā)現(xiàn)核蛋白ANP32能夠增強流感病毒聚合酶活性促進流感病毒復制；Chang等發(fā)現(xiàn)核內蛋白hnRNP A2/B1能夠與流感病毒NP蛋白相互作用影響病毒復制。

本研究在細胞內過表達hnRNP H2蛋白后影響了流感病毒的復制，通過熒光素酶活性試驗發(fā)現(xiàn)，hnRNP H2蛋白能夠抑制流感病毒聚合酶的活性。hnRNP H2蛋白是一種RNA結合蛋白，在細胞內hnRNP H2蛋白與流感病毒核酸相互作用研究中發(fā)現(xiàn)，hnRNP H2蛋白能夠與流感病毒RNA發(fā)生相互作用。這說明hnRNP H2蛋白可能通過與流感病毒的RNA結合而阻止核酸出核來發(fā)揮抑制流感病毒的作用，這將為抗流感病毒藥物研發(fā)提供思路。