分子伴侶4-苯基丁酸通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕寄生疫霉菌對(duì)植物的侵染

魏玉樹(shù)，唐雅伶，王小雪，高賢賢，單衛(wèi)星，強(qiáng)曉玉

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

蛋白質(zhì)是參與生命體代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長(zhǎng)發(fā)育的重要大分子，而蛋白質(zhì)的合成和正確的折疊修飾對(duì)其發(fā)揮功能至關(guān)重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為重要的細(xì)胞器，主要用于蛋白折疊和翻譯后修飾。真核生物中普遍存在一個(gè)負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)折疊水平的系統(tǒng)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)(Endoplasmic reticulum quality control, ERQC)。通常，ERQC可通過(guò)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶蛋白、寡聚糖轉(zhuǎn)移酶亞基等關(guān)鍵因子來(lái)維持蛋白折疊加工的穩(wěn)定秩序，以保證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的正常發(fā)揮。然而在外界環(huán)境脅迫壓力下，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量分泌蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，使得ERQC難以維持平衡，非折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的積累則引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)(Unfolded Protein Response，UPR)作為真核細(xì)胞中保守的適應(yīng)性機(jī)制，能夠通過(guò)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的感應(yīng)因子識(shí)別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活不同的信號(hào)級(jí)聯(lián)通路，增強(qiáng) ERQC 相關(guān)蛋白合成、減弱蛋白翻譯速率、加快內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白的分泌與降解，從而修復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能并維持細(xì)胞穩(wěn)定[1-3]。研究表明，健康的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和UPR在植物抵御病原菌入侵以及增強(qiáng)植物逆境適應(yīng)性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4-11]。

寄生疫霉菌(Phytophthoraparasitica)是一類典型的土傳植物病原菌，該病原菌的侵染可引發(fā)煙草黑脛病、柑橘根腐病和流膠病等多種植物病害。寄生疫霉菌的侵染循環(huán)與致病疫霉菌和大豆疫霉菌相似，既能產(chǎn)生無(wú)性游動(dòng)孢子也能產(chǎn)生厚壁的有性卵孢子。由于寄生疫霉菌的寄主范圍比較廣泛，且寄生疫霉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟，因此，寄生疫霉菌被作為一種重要模式卵菌。寄生疫霉菌具有典型的半活體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)特征，在其侵染寄主植物初期的活性營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，植物的免疫響應(yīng)尤為活躍。Qiang等[12]及鄭晴[13]借助寄生疫霉菌與模式植物擬南芥親和互作的研究體系，揭示寄生疫霉菌在早期活體營(yíng)養(yǎng)侵染階段可促使植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，并伴隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)的誘導(dǎo)激活，說(shuō)明植物響應(yīng)寄生疫霉菌早期侵染時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能受到干擾，并且產(chǎn)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激現(xiàn)象。然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生對(duì)寄生疫霉菌侵染寄主植物的影響機(jī)制尚不清楚。

4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid, 4-PBA)是一種具有分子伴侶作用的短鏈芳香族脂肪酸，它可以修復(fù)或逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)分子的錯(cuò)誤移位和錯(cuò)誤折疊，并幫助其建立正常的空間結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用[14]。因此，4-PBA也通常被定義為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激修復(fù)劑。目前，4-PBA在醫(yī)學(xué)和藥物研發(fā)等領(lǐng)域已有廣泛的報(bào)道與應(yīng)用。例如，4-PBA通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，能夠減輕動(dòng)物的神經(jīng)元損失，從而為預(yù)防治療阿爾茨海默病等神經(jīng)變性疾病提供了理論依據(jù)[15]。有研究表明，4-PBA可通過(guò)抑制PERK/Bip介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路，進(jìn)而緩解由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠的關(guān)節(jié)損傷[16]。然而，4-PBA在病原微生物引發(fā)寄主植物產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用尚不明確，尤其是在植物抵御病原微生物侵染的過(guò)程中是否發(fā)揮功能鮮有報(bào)道。本研究中，筆者對(duì)寄生疫霉菌侵染的擬南芥植株進(jìn)行4-PBA處理，發(fā)現(xiàn)低濃度4-PBA在不影響植物正常生長(zhǎng)的同時(shí)，不僅能夠緩解由病菌侵染而誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而且可有效減輕寄生疫霉菌在植物體內(nèi)的定殖生物量，從而緩解植物的感病表型。這為深入揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)植物與微生物互作的影響機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，并為開(kāi)發(fā)新型藥物靶點(diǎn)應(yīng)用于作物疫霉屬卵菌病害的綠色綜合防控提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 植物材料，病原菌接種及4-PBA處理

植物材料：擬南芥野生型Col-0種子，寄生疫霉菌(帶綠色熒光蛋白GFP的轉(zhuǎn)化菌株，1121)由西北農(nóng)林科技大學(xué)單衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基：5%固體CA培養(yǎng)基(胡蘿卜汁25 mL、CaCO30.05 g、β-谷甾醇10 mg、瓊脂3.75 g， 加水定容至500 mL，121 ℃濕熱滅菌 30 min)。鹽溶液(5 mmol/L KNO3、0.02 mmol/L FeSO4、4 mmol/L MgSO4、10 mmol/L CaNO3、0.02 mmol/L EDTA-Na2)。

擬南芥皿內(nèi)種植：用滅菌水清洗種子表面雜質(zhì)，用75%乙醇處理種子1 min，立即用滅菌水清洗種子表面乙醇，再用1%次氯酸鈉處理10 min，用滅菌ddH2O沖洗種子4次，最后將種子置于滅菌濾紙上吹干，于4 ℃冰箱中黑暗放置3 d后，在超凈工作臺(tái)中用移液槍點(diǎn)于培養(yǎng)基上，在23 ℃植物培養(yǎng)箱(光照12 h，黑暗12 h)中培養(yǎng)，用于生長(zhǎng)敏感性分析的幼苗于10 d后處理，用于接菌處理的幼苗于2周后處理。

基質(zhì)種植的擬南芥：將種子點(diǎn)在基質(zhì)上(腐殖土∶蛭石=2∶1)，封上保鮮膜。轉(zhuǎn)移到 23 ℃恒溫培養(yǎng)室中，10 d后去除保鮮膜，生長(zhǎng)4周后備用。

擬南芥皿內(nèi)接菌：將實(shí)驗(yàn)室保存的寄生疫霉菌株(1121)挑到5%固體CA培養(yǎng)基上，于23 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d。將固培好的寄生疫霉菌用牙簽分割成小片，倒入5%CA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～4 d。在超凈臺(tái)中倒掉液體CA，浸沒(méi)在鹽溶液中，鹽培5～7 d，可用于接菌。將鹽培好的寄生疫霉菌倒掉鹽溶液，加入超純水，清洗2次，之后加入適量dH2O，放入4 ℃冰箱中30 min。之后，將鹽培的寄生疫霉菌放入23 ℃培養(yǎng)箱中，刺激30 min。于顯微鏡下觀察游動(dòng)孢子情況，用血球計(jì)數(shù)板配置成濃度為 100 個(gè)/μL的孢子懸浮液。

皿內(nèi)游動(dòng)孢子蘸根接菌：取生長(zhǎng)10 d的擬南芥從培養(yǎng)基中輕輕拔出，將根部置于孢子懸浮液中浸泡 15 s，將多余的液滴去除，放置于不含糖的1/2MS培養(yǎng)基中，以水處理為對(duì)照，封口后將培養(yǎng)基放于培養(yǎng)箱中。12 h后觀察表型。每個(gè)處理3次重復(fù)。

4-PBA處理：將4-PBA稀釋至1 μmol/L ，按照蘸根接菌的方法，用4-PBA處理擬南芥皿內(nèi)接種寄生疫霉游動(dòng)孢子12 h后的根部，12 h后在熒光顯微鏡下用紫外線或者藍(lán)光觀察并測(cè)量其鮮質(zhì)量和收樣。同時(shí)，用1 μmol/L 4-PBA溶液和相應(yīng)的對(duì)照溶液噴灑處理培養(yǎng)6周的擬南芥活體植株， 并于處理后3 d、5 d和10 d對(duì)植株的生長(zhǎng)表型進(jìn)行觀察。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2 取樣稱量及 RNA提取

收取蘸取無(wú)菌水5 d苗齡的擬南芥野生型Col-0的根部樣品(Mock)，接種寄生疫霉菌的擬南芥根部12 h樣品(P.p)，接種寄生疫霉菌12 h后4-PBA處理的擬南芥根部樣品(P.p+Mock)。將收取好的樣品在天平上稱取各樣品鮮質(zhì)量，之后于液氮中研磨至粉末狀，采用TRIZOL(invitrogen)試劑說(shuō)明書(shū)的方法提取擬南芥根樣的總RNA，并用核酸蛋白微量檢測(cè)儀(Nanodrop)檢測(cè)RNA的純度。參考TaKara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script TM RT regent kit，貨號(hào) RR047A)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：根據(jù)測(cè)定好的RNA濃度，計(jì)算出反轉(zhuǎn)錄所需的RNA量；并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.3 定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)分析

利用在線軟件(http://sg.idtdna.com/p rimer quest/ Home/Index)設(shè)計(jì)AtBIP3的qRT-PCR特異性檢測(cè)引物，以編碼擬南芥泛素綴合酶的基因(Ubiq uitin-carrier enzymes 9,AtUBC9)為內(nèi)參基因，檢測(cè)寄生疫霉菌定殖量的寄生疫霉菌WS014(PPTG_09948)為檢測(cè)基因(表1)。qRT-PCR檢測(cè)采用LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler 480, Roche), 使用SYBR GreenI染料(Roche, 德國(guó))。qRT-PCR體系(20 μL)，ddH2O 7.4 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，模板1 μL(終濃度為10 ng/μL)。qRT-PCR程序：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)。基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt法。每個(gè)處理3次重復(fù)。

表1 qRT-PCR所用引物序列Table 1 Primers used in qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 4-PBA可緩解由寄生疫霉菌侵染而誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

相比對(duì)照植株，接種寄生疫霉菌的植株鮮質(zhì)量下降約60%(圖1-A)，說(shuō)明植物在病菌侵染時(shí)呈現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)受阻表型；而寄生疫霉菌和4-PBA共處理的植株鮮質(zhì)量下降約40%(圖1-A)，說(shuō)明4-PBA在一定程度上可緩解病菌侵染引發(fā)的植物生長(zhǎng)受阻表型。

A.10 d苗齡的擬南芥野生型Col-0植株分別進(jìn)行寄生疫霉菌游動(dòng)孢子蘸根接種和對(duì)照處理，接菌12 h之后又進(jìn)行1 μmol/L 4-PBA和對(duì)照處理，對(duì)植株的鮮質(zhì)量在處理后12 h進(jìn)行測(cè)量和分析。結(jié)果代表3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。每組選取20棵左右的植株進(jìn)行分析。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性驗(yàn)證(“*”代表P-value<0.05，有顯著差異，“**”代表P-value<0.01，有極顯著差異)B.qRT-PCR分析UPR標(biāo)記基因 BiP3的表達(dá)水平。兩周苗齡的擬南芥Col-0根部進(jìn)行寄生疫霉菌游動(dòng)孢子接菌和對(duì)照處理，并于接菌3 h后進(jìn)行1 μmol/L 4-PBA和對(duì)照處理，并于處理12 h收取根樣，提取總RNA。結(jié)果代表3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性驗(yàn)證(“*”代表P-value<0.05，有顯著差異，“**”代表P-value<0.01，有極顯著差異)A.Ten-day-old Col-0 seedlings were dip-inoculated by P.parasitica zoospores or treated with mock solution and thereafter followed with the treatment of 1 μmol/L 4-PBA at 12 hpi. Plant biomass was determined at 12 h post treatment. Data presentthree independent experiments±SE. For each experiment, 20 plants were analyzed per treatment. Asterisks indicate significance at P<0.05(*) and P<0.01(**) analyzed by student’s t-testB.The expression levels of UPR marker gene BIP3 were evaluated by qRT-PCR. Two-week-old A.thaliana Col-0 plant roots were dip-inoculated by P.parasitica zoospores or treated with mock solution and followed with the treatment of 1 μmol/L 4-PBA at 3 hpi. Total RNA was extracted from 4-PBA/mock treated roots at 12 h. Data presentthree independent experiments±SE.Asterisks indicates significant differences at P<0.05(*) and P<0.01(**) analyzed by student’s t-test圖1 4-PBA可緩解寄生疫霉菌侵染引起的植物生長(zhǎng)受阻及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)的誘導(dǎo)激活擬南芥野生型Col-0植株鮮質(zhì)量的測(cè)量Fig.1 4-PBA attenuates plant growth retardation and ER stress response induced upon infection with P.parasitica fresh mass analysis on A.thaliana Col-0 seedlings

qRT-PCR結(jié)果表明，編碼蛋白折疊伴侶的BiP3表達(dá)水平被寄生疫霉菌顯著誘導(dǎo)上調(diào)(圖1B)[8]，而4-PBA在一定程度上減弱BiP3被寄生疫霉菌誘導(dǎo)表達(dá)的水平(圖1-B)。4-PBA可緩解寄生疫霉菌侵染而誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

2.2 4-PBA顯著減輕寄生疫霉菌對(duì)植物組織的侵染程度

接種寄生疫霉菌的擬南芥植株根部明顯被菌絲覆蓋，相比而言，處理4-PBA后明顯減少菌絲在寄主植物根部上的擴(kuò)展(圖2-A)。

A.10 d苗齡的擬南芥Col-0植株根部首先進(jìn)行寄生疫霉菌游動(dòng)孢子接菌，并于接菌6 h后分別進(jìn)行1 μmol/L 4-PBA和對(duì)照處理。處理后的植株放置于1/2 MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)3 d后病菌的侵染及擬南芥植株的生長(zhǎng)狀態(tài)觀察B.分別選取不同處理中20棵幼苗進(jìn)行葉片褪綠黃化統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果代表3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性驗(yàn)證(“**”代表P-value<0.01，有極顯著差異)A.Ten-day-old Col-0 roots were dip-inoculated by P.parasitica zoospores and followed with the treatment of 1 μmol/L 4-PBA and mock solution at 6 hpi. After treatment of 4-PBA/mock solution, seedlings were grown on 1/2MS medium for 3 d and followed with the observation of P.parasitica infection and plant growth phenotypeB.Twenty seedlings from different treatments were used to analyze the ratio of leaf chlorosis. Data present three independent experiments±SE. For each experiment, 20 plants were analyzed per treatment. Asterisks indicates significance at P<0.01(**) analyzed by student’s t-test圖2 4-PBA顯著減輕寄生疫霉菌對(duì)植物組織的侵染Fig.2 4-PBA attenuates colonization of P.parasitica on plant tissue

通過(guò)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)和分析擬南芥幼苗葉片的褪綠黃化率可發(fā)現(xiàn)，相比寄生疫霉菌侵染引起的植株褪綠黃化，處理4-PBA能夠明顯抑制植株萎黃死亡的表型(圖2-A)，并顯著降低由寄生疫霉菌侵染導(dǎo)致的植株萎黃死亡率(圖2-B)。由此說(shuō)明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生能夠影響植物與疫霉菌的親和互作，4-PBA可能通過(guò)緩解由寄生疫霉菌侵染引發(fā)的植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而減輕病菌對(duì)植物組織的侵染程度。

2.3 4-PBA可抑制寄生疫霉菌在植物體內(nèi)的擴(kuò)展和定殖

相比寄生疫霉菌在根組織細(xì)胞內(nèi)形成吸器并產(chǎn)生大量的菌絲體(圖3-B)，4-PBA的處理使得根部細(xì)胞中寄生疫霉菌吸器的形成以及菌絲的擴(kuò)展被明顯抑制(圖3-A)，揭示了4-PBA能夠影響寄生疫霉菌在植物體內(nèi)的定殖和擴(kuò)展。

10 d苗齡的擬南芥Col-0植株根部首先進(jìn)行寄生疫霉菌游動(dòng)孢子接菌，并于接菌6 h后分別進(jìn)行1 μmol/L 4-PBA和對(duì)照處理。 A-D.處理12 h后在熒光顯微鏡下觀察不同處理下病菌的侵染情況。標(biāo)尺=50 μm。E.處理12 h后的根樣用于提取總RNA，利用寄生疫霉菌管家基因WS014引物和擬南芥UBC9引物進(jìn)行qRT-PCR，定量分析寄生疫霉菌的生物量。數(shù)據(jù)表示4-PBA處理相比于對(duì)照處理下，寄生疫霉菌的相對(duì)生物量。結(jié)果代表3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性驗(yàn)證(“**”代表P-value<0.01，有極顯著差異)Ten-day-old Col-0 roots were dip-inoculated by P.parasitica zoospores and followed with the treatment of 1 μmol/L 4-PBA and mock solution at 6 hpi. A-D.After 12h post 4-PBA treatment, the colonization of P.parasitica were observed under epifluorescence microscope. Bar=50 μm.E.After 12h post 4-PBA treatment, the roots were harvested for total RNA extraction. Using the primers of P.parasiticaWS014 and A.thaliana UBC9, qRT-PCR was employed to quantitate the biomass of P.parasitica. The ordinate indicates biomass of P.parasitica in 4-PBA treated seedlings relative to that in mock treatment seedlings. Data presentthree independent experiments±SE. Asterisks indicates significance at P<0.01(**) analyzed by student’s t-test圖3 4-PBA能夠減輕寄生疫霉菌在擬南芥根部的擴(kuò)展和定殖Fig.3 4-PBA alleviates colonization of P.parasitica on A.thaliana roots

通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析了不同處理下寄生疫霉菌定殖于植物根組織中的生物量。與熒光顯微鏡觀察結(jié)果相一致，可見(jiàn)相比寄生疫霉菌和對(duì)照溶液共處理的根部組織，寄生疫霉菌和4-PBA共處理的根部呈現(xiàn)出顯著減少的寄生疫霉菌生物量(圖3-E)，說(shuō)明4-PBA能夠抑制寄生疫霉菌在植物根部組織中的定殖生物量。

2.4 4-PBA不影響植物正常的生長(zhǎng)表型

與對(duì)照相比，濃度分別為0.1 μmol/L、0.5 μmol/L和1 μmol/L的 4-PBA處理后1 d、3 d和5 d的擬南芥幼苗呈現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)表型(圖4-A)，并且植株鮮質(zhì)量并無(wú)明顯差異(圖4-B)。

A-B.生長(zhǎng)于1/2MS培養(yǎng)基2周的擬南芥Col-0根部分別進(jìn)行0.1 μmol/L 、0.5 μmol/L和1 μmol/L 4-PBA處理和對(duì)照處理，并于處理后1 d、3 d和5 d對(duì)幼苗的生長(zhǎng)表型進(jìn)行了觀察和記錄；對(duì)植株的鮮質(zhì)量在處理后1 d、3 d和5 d后分別進(jìn)行了測(cè)量和分析。結(jié)果代表3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。每組試驗(yàn)中選取20棵左右的植株進(jìn)行分析。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性驗(yàn)證(“N.S”代表無(wú)顯著差異)。C.6周苗齡的擬南芥Col-0活體植株噴施1 μmol/L 4-PBA和對(duì)照溶液，并于處理后3 d、5 d和10 d后進(jìn)行生長(zhǎng)表型觀察和記錄A-B.Two-week-old A.thaliana Col-0 roots were treated with 0.1 μmol/L ,0.5 μmol/L and 1 μmol/L 4-PBA as well as respective mock solution. The growth phenotype of seedlings was observed and recorded at 1d, 3d and 5d post treatment and the seedlings’ fresh mass was measured and analyzed at indicated time points. Data present three independent experiments±SE. Twenty seedlings were analyzed in each group of experiment. N.S. indicates no significance analyzed by student’s t-test.C.Six-week-old A.thaliana Col-0 plants were spray-treated with 1 μmol/L 4-PBA and mock solution. The plant growth phenotype were observed and recorded at 3 d, 5 d and 10 d post treatment圖4 4-PBA不影響植物正常的生長(zhǎng)表型Fig.4 4-PBA does not affect the plant growth phenotype

此外，還用1 μmol/L 4-PBA溶液和相應(yīng)的對(duì)照溶液噴灑處理6周大的擬南芥活體植株，并于處理后3 d、5 d和10 d對(duì)植株的生長(zhǎng)表型進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：和對(duì)照處理相比，1 μmol/L的4-PBA處理的擬南芥植株生長(zhǎng)表型并沒(méi)有明顯變化(圖4-C)。上述結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的4-PBA并不會(huì)影響植物正常的生長(zhǎng)表型。

3 討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中最為重要的細(xì)胞器之一，是蛋白質(zhì)合成與折疊以及翻譯后修飾、脂類和固醇合成、維持Ca2+動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵功能位點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能處于紊亂狀態(tài)時(shí)，會(huì)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，產(chǎn)生一系列細(xì)胞反應(yīng)，參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展[17]。相比而言，盡管植物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及UPR信號(hào)機(jī)制仍有待深入研究，已有研究揭示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在植物對(duì)病原菌的免疫應(yīng)答中具有中心調(diào)節(jié)作用，當(dāng)其正常功能被干擾或破壞時(shí)，會(huì)促進(jìn)病菌入侵寄主細(xì)胞[4,12,18]。因此，提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的穩(wěn)定性并探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生機(jī)制對(duì)于增強(qiáng)作物逆境適應(yīng)性，并推進(jìn)綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的科學(xué)意義。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥在響應(yīng)寄生疫霉菌早期侵染時(shí)，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路被誘導(dǎo)激活[12]。本研究結(jié)果顯示，相比于對(duì)照處理中擬南芥植株的健康生長(zhǎng)表型，寄生疫霉菌侵染24 h的擬南芥Col-0植株呈現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)受阻表型(圖1-A)，該生長(zhǎng)敏感表型進(jìn)一步證實(shí)寄生疫霉菌的侵染能夠引發(fā)植物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生。由此可推測(cè)：病菌誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能有助于病菌對(duì)寄主植物的成功侵染。

分子伴侶4-PBA是一種短鏈芳香族脂肪酸，在哺乳動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，4-PBA能夠有效緩解衣霉素和毒胡蘿卜素等應(yīng)激化學(xué)誘導(dǎo)劑引發(fā)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[19]。同時(shí)，研究證明4-PBA可減輕原代背根神經(jīng)結(jié)神經(jīng)元高糖血癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，但并不改變細(xì)胞活力和鈉通道的表達(dá)[5]。然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激修復(fù)劑4-PBA對(duì)植物抵御病原菌侵染的影響及其在植物與微生物互作中的功能研究鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果表明，4-PBA不僅能夠緩解由寄生疫霉菌侵染引發(fā)的植株生長(zhǎng)受阻的表型(圖1-A)，還明顯減弱寄生疫霉菌早期侵染引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)標(biāo)記基因AtBiP3的誘導(dǎo)表達(dá)水平(圖1-B)，揭示分子伴侶4-PBA對(duì)于寄生疫霉菌侵染而誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有一定程度的修復(fù)和緩解作用。

而4-PBA能夠顯著減輕寄生疫霉菌對(duì)植物組織的侵染以及植株的萎黃死亡率(圖2-A, 2-B)，揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生可能是促進(jìn)病菌侵染的關(guān)鍵因素。最近的研究也證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感應(yīng)因子bZIP60和bZIP28缺失的擬南芥突變體對(duì)寄生疫霉菌呈現(xiàn)感病表型[12]。因此，推測(cè)4-PBA可能通過(guò)緩解病菌引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持ERQC的穩(wěn)定，從而促使植物的免疫系統(tǒng)得到恢復(fù)，以更有效地抵御病菌的入侵。同時(shí)，4-PBA能夠抑制寄生疫霉菌在植物體內(nèi)的擴(kuò)展和定殖(圖3)，該結(jié)果揭示4-PBA對(duì)抑制寄生疫霉菌的定殖和擴(kuò)展也具有重要作用。

值得注意的是：適當(dāng)濃度的4-PBA對(duì)擬南芥幼苗的生長(zhǎng)及鮮質(zhì)量并無(wú)顯著影響(圖4-A，4-B)，并且對(duì)活體植株的正常生長(zhǎng)也無(wú)明顯影響(圖4-C)，這說(shuō)明4-PBA對(duì)植物的生長(zhǎng)并無(wú)化學(xué)藥劑的負(fù)效應(yīng)，也證明其在作物抗病以及綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有良好的潛在應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激修復(fù)劑4-PBA在不影響植物正常生長(zhǎng)的同時(shí)，不僅能夠緩解寄生疫霉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，還對(duì)寄生疫霉菌在植物體內(nèi)的擴(kuò)展和定殖具有抑制作用。因此，4-PBA作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激修復(fù)劑，有望作為一種新型的藥物靶點(diǎn)應(yīng)用于作物疫霉屬卵菌病害的綠色綜合防控，同時(shí)也為探索綠色和可持續(xù)發(fā)展的抗病新途徑提供了新思路。