苯磺隆對抗除草劑甘藍(lán)型油菜K4的殺雄效果

呂慧杰，王紅梅，趙天天，張東鎖，郭 媛，胡勝武

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

油菜是中國乃至世界重要的油料作物，是人類食用植物油的重要來源，也是動(dòng)物飼料中蛋白質(zhì)的重要來源。大力發(fā)展油菜產(chǎn)業(yè)對于中國食用植物油安全供給，增加菜農(nóng)收入，實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略具有非常重要的意義[1]。油菜雜種優(yōu)勢顯著，目前利用油菜雜種優(yōu)勢的主要途徑包括細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)、細(xì)胞核雄性不育(GMS)、生態(tài)型雄性不育(Ecological male sterility,EMS)、化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)的雄性不育(CIMS)和自交不親和(SI)等[2-3]。其中，CIMS具有親本選配自由、后代無胞質(zhì)不良效應(yīng)、育種周期短、雜交種在生產(chǎn)上不會(huì)出現(xiàn)不育株，甚至還可以利用F2代等優(yōu)點(diǎn)[4]，受到中國廣大油菜育種工作者的青睞。中國油菜科研人員在新型化學(xué)雜交劑的篩選、研發(fā)及兩系雜交種育種方面做了大量工作。目前，國內(nèi)外公開報(bào)道的適用于油菜的化學(xué)雜交劑或其有效成分主要有殺雄劑1號(hào)[5]、KMS-1[6]、ESP[7]、EN[8]、SX-1[9]、苯磺隆(tribenuron methyl, TBM)[10-13]、化殺靈WP[14]、單嘧磺酯鈉(monosulphuronester sodium)[15]、胺磺隆(amidosulfuron)[16]等。其中，TBM屬于磺酰脲類化學(xué)除草劑，低濃度使用時(shí)對甘藍(lán)型油菜等數(shù)十種十字花科植物殺雄效果良好，是一種高效的油菜化學(xué)雜交劑成分[11-12,17-18]。目前，利用該技術(shù)已經(jīng)育成‘湘雜油’‘渝黃’‘秦優(yōu)’‘陜油’等系列油菜雜交種，并在生產(chǎn)中廣泛推廣利用[4,17]。

在利用化學(xué)雜交劑進(jìn)行油菜兩系雜交種制種時(shí)，當(dāng)給母本噴施化學(xué)雜交劑時(shí)，一般要對父本進(jìn)行遮擋，以保證父本花朵安全，以便產(chǎn)生大量可育花粉。然而，遮擋過程增加了勞動(dòng)力投入，使制種成本提高。因此，利用抗除草劑(TBM)的油菜突變體作為父本，無需遮擋，可以簡化油菜兩系雜交種制種程序，對油菜雜種優(yōu)勢的利用及實(shí)際生產(chǎn)具有重要意義[19]。乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase,ALS)基因發(fā)生突變是油菜對TBM產(chǎn)生抗性的原因，目前利用自然突變、化學(xué)誘變或基因編輯技術(shù)已獲得若干油菜ALS基因突變體，例如PM1和M9 (S653A in BnALS1)、PM2 和M342(T574L in BnALS3)、PN19(T574L in BnALS1)、5N(T574L in BnALS1和BnALS3)、M45(P197S/L in BnALS3)、K4(P197S in BnALS3)和K5(P197S in BnALS1)等[20-28]。Li等[19]在抽薹期對油菜突變體M45及其野生型HS5噴施0.05 mg/L TBM，發(fā)現(xiàn)HS5植株生長及育性受到嚴(yán)重影響，而突變體M45植株未受到影響，且花粉完全可育。然而，關(guān)于抽薹期噴施不同劑量(濃度)TBM對油菜ALS基因突變材料生長發(fā)育的影響，以及誘導(dǎo)其雄性不育的TBM劑量的研究鮮有報(bào)道。西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜研究中心生物技術(shù)育種課題組(以下稱本課題組)研究發(fā)現(xiàn)，在抽薹期葉面噴施20.00 mg/L TBM，可誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜抗除草劑突變體K5完全雄性不育，而野生型ZS9則在噴施0.10 mg/L TBM時(shí)就完全雄性不育[20]。K5的BnALS1基因的544位點(diǎn)處堿基由C突變?yōu)門 (BnALS1544T)，導(dǎo)致BnALS1蛋白的182位由Pro突變?yōu)镾er[29]。

甘藍(lán)型油菜抗除草劑突變體K4，是本課題組利用甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)誘變甘藍(lán)型油菜ZS9，得到的另一個(gè)抗除草劑TBM的突變體[30]。研究表明，該突變體BnALS3基因535位由C突變?yōu)門(BnALS3535T)，導(dǎo)致其編碼的BnALS3蛋白179位Pro變?yōu)镾er[25]。本研究以甘藍(lán)型油菜突變體K4為材料，通過抽薹期噴施不同濃度TBM，觀察TBM處理對K4的花粉育性、花器官形態(tài)以及主要農(nóng)藝性狀的影響，從而明確誘導(dǎo)油菜突變體K4雄性不育的TBM劑量。研究結(jié)果將為抗除草劑油菜在化學(xué)殺雄兩系雜交種育種中的有效利用提供骨干材料及理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及化學(xué)藥劑

供試材料為甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)抗TBM突變體K4及其野生型ZS9。該突變體是ZS9經(jīng)過EMS誘變的M2代群體，噴施TBM篩選得到[30]；其BnALS3基因535位由C突變?yōu)門(BnALS3535T)，導(dǎo)致其編碼的BnALS3蛋白179位Pro突變?yōu)镾er(對應(yīng)擬南芥AtALS-197位)[25]。

化學(xué)雜交劑由苯磺隆(TBM)配置而成。TBM可濕性粉劑，有效成分含量10%(麥發(fā)牌，沈陽市和田化工有限公司)。取1 g TBM溶于500 mL水，配制成2.00 mg/mL的母液，噴藥前將母液稀釋成不同濃度的工作液，對照用純水。

1.2 試驗(yàn)方法

田間試驗(yàn)于2018年─2020年2個(gè)生長季節(jié)進(jìn)行。2018年和2019年9月下旬將材料播種于陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)作物標(biāo)本園 (N34.29°，E108.06°)，小區(qū)種植，行長2 m，行距0.2 m，株距0.1 m。一般大田管理。

1.2.1 噴藥處理 于油菜抽薹期，最大花蕾長度1～2 mm時(shí)，對K4與ZS9植株進(jìn)行噴藥處理。 2 a試驗(yàn)分別于2019-03-14、2020-03-03第1次對材料進(jìn)行葉面噴施，單株受藥量約6 mL，7 d后進(jìn)行第2次噴施。其中，K4設(shè)0.00 mg/L(對照)、1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、7.50 mg/L、10.00 mg/L和12.50 mg/L共設(shè)7個(gè)TBM濃度處理，ZS9設(shè)0.00 mg/L(對照)、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L共4個(gè)TBM濃度處理。田間試驗(yàn)每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5行，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。

1.2.2 花器官觀察 在盛花期各濃度處理小區(qū)中，隨機(jī)選擇10株，每株選取主花序的5朵花，對花瓣長、花瓣寬、雄蕊長度和雌蕊長度進(jìn)行測定，并對花和花序進(jìn)行拍照記錄。

1.2.3 育性統(tǒng)計(jì) 不育花粉率統(tǒng)計(jì)：在花期取不同濃度處理后的K4和ZS9的花蕾放入70%酒精保存，每個(gè)濃度處理選3個(gè)花蕾，剝開花藥壓碎混勻，用醋酸洋紅壓片染色，在顯微鏡(Olympus BX51，日本)下檢測花粉活力并拍照，統(tǒng)計(jì)不育花粉與總花粉數(shù)，計(jì)算不育花粉率。

不育株率統(tǒng)計(jì)：將植株上有連續(xù)5朵以上雄性不育花的植株定義為雄性不育株，統(tǒng)計(jì)不育株數(shù)與小區(qū)內(nèi)植株總數(shù)，計(jì)算不育株率。

1.2.4 農(nóng)藝性狀考察 在油菜成熟期，各處理小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選擇10株，測定以下農(nóng)藝性狀：株高、分枝部位、一次有效分枝數(shù)、主花序長度、主花序角果數(shù)、全株角果數(shù)、每果粒數(shù)、角果長度、千粒質(zhì)量和單株產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性分析使用Duncan’s法，P<0.05。表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度TBM處理對突變體K4花器官及育性的影響

為探明誘導(dǎo)突變體K4雄性不育的TBM劑量范圍，抽薹期利用不同濃度的TBM對K4和其野生型ZS9進(jìn)行葉面噴施處理。結(jié)果表明，ZS9隨著TBM處理濃度的升高，花莖變紫色(圖1- A1～D1)，花器官(花瓣長、花瓣寬、雌蕊長、雄蕊長)變小(表1；圖1-A2～D2)，花粉不育率(表2；圖1-A3～D3)及雄性不育株率升高(表2；圖1- A4～D4)，其中，0.10 mg/L TBM處理可誘導(dǎo)ZS9完全雄性不育。K4隨著TBM處理濃度的升高，花莖略微變色(圖2-A1～G1)，花器官(花瓣長、花瓣寬、雌蕊長、雄蕊長)變小(表3；圖2- A2～G2)，花粉不育率(表4；圖2-A3～G3)及雄性不育株率升高(表4；圖2-A4～G4)，在10.00 mg/L TBM處理下可誘導(dǎo)K4完全雄性不育。

表1 不同濃度苯磺隆處理下ZS9花器官形態(tài)Table 1 Floral organ morphology of ZS9 under different concentrations of tribenuron methyl

A～D分別代表TBM處理濃度為0.00 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L;1～4分別代表花序、花、花粉活力、自交結(jié)實(shí)情況A-D represents 0.00 mg/L, 0.05 mg/L, 0.10 mg/L and 0.50 mg/L of TBM treatment，respectivelyt; 1-4 represents inflorescence, flower, pollen vigor and bagged seed-settings，respectively

表2 不同濃度苯磺隆處理下ZS9的育性情況Table 2 Male sterility of ZS9 induced by different concentrations of tribenuron methyl

A～G分別代表TBM處理濃度為0.00 mg/L、1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、7.50 mg/L、10.00 mg/L和12.50 mg/L;1～4分別代表花序、花、花活力自交結(jié)實(shí)情況A-G represent 0.00 mg/L,1.00 mg/L,2.50 mg/L,5.00 mg/L,7.50 mg/L,10.00 mg/L,12.50 mg/L of TBM treatment,respectively;1-4 represents inflorescence,flower,pollen vigor and bagged seed-settings,respectively圖2 不同濃度苯磺隆處理下突變體K4花器官、花粉活力及自交結(jié)實(shí)情況Fig.2 Morphology of floral organs, pollen viability and bagged seed-setting of mutant K4 under different concentrations of tribenuron methyl

表3 不同濃度苯磺隆處理下K4花器官形態(tài)Table 3 Floral organ morphology of K4 under different concentrations of tribenuron methyl

表4 不同濃度苯磺隆處理下K4突變體的育性情況Table 4 Male sterility of mutant K4 induced by different concentrations of tribenuron methyl

與ZS9比較，K4能耐受更高濃度的TBM。在不同濃度TBM處理后，K4花莖變色較ZS9更輕微，花粉不育率和雄性不育株率升高慢，誘導(dǎo)K4完全雄性不育的TBM濃度(10.00 mg/L)是ZS9(0.10 mg/L)的100倍。

2.2 不同濃度TBM處理對K4農(nóng)藝性狀的影響

ZS9在不同濃度TBM噴藥處理后，與對照比較，除角粒數(shù)顯著降低外，單株產(chǎn)量、千粒質(zhì)量和全株角果數(shù)等其他9個(gè)性狀無顯著差異(表5)。

表5 不同濃度苯磺隆處理下ZS9主要農(nóng)藝性狀Table 5 Main agronomic traits of ZS9 underdifferent concentrations of tribenuron methyl TBM

K4在不同濃度TBM處理后，除分枝數(shù)、主花序長度、全株角果數(shù)與對照比較無顯著差異外，其他7個(gè)性狀均存在顯著差異(表6)。角果長度在1.00 mg/L TBM處理下，與對照比較就已顯著減?。唤橇?shù)在5.00 mg/L TBM處理下，與對照比較出現(xiàn)顯著降低；主花序角果數(shù)則在10.00 mg/L TBM處理下，與對照比較存在顯著差異；株高、分枝部位、千粒質(zhì)量、單株產(chǎn)量則在12.50 mg/L TBM處理下，與對照比較存在顯著差異，且均比對照顯著降低。在誘導(dǎo)K4完全雄性不育的10.00 mg/L TBM處理下，除主花序角果數(shù)、角果長度、每角粒數(shù)與對照相比顯著降低外，單株產(chǎn)量等其他7個(gè)性狀與對照均無顯著差異。

表6 不同濃度苯磺隆處理下K4主要農(nóng)藝性狀Table 6 Main agronomic traits of mutant K4 under different concentrations of tribenuron methyl TBM

3 討 論

利用化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)雄性不育已成為油菜雜種優(yōu)勢利用的一個(gè)重要授粉控制系統(tǒng)[3-4]。在利用化學(xué)雜交劑進(jìn)行油菜兩系雜交種制種時(shí)，當(dāng)給母本噴施化學(xué)雜交劑時(shí)，一般要對父本進(jìn)行遮擋，以保證父本安全、花粉可育，這個(gè)過程將增加制種成本。中國科研人員研究發(fā)現(xiàn)，磺酰脲類化學(xué)除草劑TBM在低濃度使用時(shí)，對甘藍(lán)型油菜等多種十字花科植物具有良好的殺雄效果，是一種高效的油菜化學(xué)雜交劑成分[11-13,17-18,31]。有學(xué)者提出，利用抗化殺劑(TBM)的油菜作為父本，噴藥時(shí)父本無需遮擋，從而可以簡化兩系雜交種制種程序[19]。本研究以抗TBM的甘藍(lán)型油菜突變體K4為材料，在抽薹期葉面噴施不同濃度的TBM，研究其誘導(dǎo)雄性不育的效果，探究誘導(dǎo)K4雄性不育的最適TBM濃度。結(jié)果表明，在0.10 mg/L×6 mL TBM劑量處理下，野生型ZS9就已經(jīng)產(chǎn)生100%雄性不育，主要農(nóng)藝性狀未受顯著影響，這與前人結(jié)果基本一致[11-12,19-20]；而 10.00 mg/L×6 mL TBM劑量處理才能誘導(dǎo)K4完全雄性不育，該TBM劑量是誘導(dǎo)ZS9雄性不育劑量的100倍。Lv等[20]研究報(bào)道，在20.00 mg/L×5 mL TBM處理才能誘導(dǎo)抗除草劑突變體K5雄性不育，該劑量大約是誘導(dǎo)K4雄性不育劑量的兩倍。誘導(dǎo)K4和K5雄性不育TBM劑量差異的原因可能是二者突變基因不同。K4的BnALS3基因的535位點(diǎn)處堿基由C突變?yōu)門(BnALS3535T)，導(dǎo)致BnALS3蛋白的179位由Pro突變?yōu)镾er[25,32]；K5的BnALS1基因的544位點(diǎn)處堿基由C突變?yōu)門(BnALS1544T)，導(dǎo)致BnALS1蛋白的182位由Pro突變?yōu)镾er，雖然這兩個(gè)突變位點(diǎn)均對應(yīng)擬南芥的AtALS-197位。Guo等[26]研究報(bào)道，甘藍(lán)型油菜EMS突變體M342(T574L in BnALS3)和PN19(T574L in BnALS1)突變位點(diǎn)均對應(yīng)擬南芥的AtALS-574位，但二者對除草劑TBM和MES(mesosulfuron)苗期抗性也存在差異。因此，推測突變基因以及突變位點(diǎn)的不同可能會(huì)造成突變體對殺雄劑的抗性不同。

此外，研究發(fā)現(xiàn)外施TBM導(dǎo)致油菜花莖變色等現(xiàn)象，下一步測量相關(guān)激素如花青素等的含量變化，雄蕊敗育的細(xì)胞學(xué)特征，以及基因表達(dá)變化情況等，以期揭示苯磺隆誘導(dǎo)油菜ALS基因突變體雄性不育的機(jī)理?？傊琄4是一個(gè)很好的抗化殺劑(TBM)的親本材料，在兩系制種中作為父本材料使用可簡化制種程序，降低制種成本。該研究結(jié)果為油菜化殺兩系育種提供了重要的理論參考和育種親本材料。