子癇前期患者血小板促凝亞群形成水平升高*

褚雅歆，劉佳新，楊靜，郭晗，張云聰，楊碩，喬蕊（1.北京大學第三醫(yī)院a.檢驗科，b.婦產(chǎn)科，北京 100191；.北京積水潭醫(yī)院檢驗科，北京 100035）

子癇前期（preeclampsia，PE）是嚴重影響母嬰健康的妊娠并發(fā)癥，以妊娠20周后新發(fā)高血壓（≥140/90 mmHg）和蛋白尿（尿蛋白≥0.3 g/24 h）為特征，可迅速進展至危及生命的子癇［1］。目前除終止妊娠外，PE尚無其他有效治療措施［2］。雖然PE發(fā)病機制尚不明確，但是胎盤缺血-再灌注損傷通常會導致母體全身血栓-炎癥反應綜合癥［3-4］——使母體出現(xiàn)廣泛的血管內(nèi)皮功能障礙和止血系統(tǒng)過度激活。小劑量阿司匹林（100～150 mg/d）抗血小板治療是目前唯一被證明具有PE預防作用的措施［5］，提示血小板激活在PE母體血栓-炎癥反應的發(fā)生或進展中可能發(fā)揮著重要作用。

血小板在激活后形成的血小板促凝亞群可以大量釋放同時具有促炎癥和促凝作用的血小板微粒（platelet microparticle，PMP）［6-9］，所以該群血小板極有可能參與了PE母體全身血栓-炎癥的發(fā)生或進展過程。因此，為了證明PE發(fā)生過程中，血小板激活是否會形成異常升高的促凝亞群，本研究首先利用流式細胞術(shù)構(gòu)建了血小板促凝亞群檢測方法，進而探索了血小板促凝亞群形成在PE和正常妊娠過程中的水平差異。

1 對象和方法

1.1 研究對象 自2020年10月至2021年6月，連續(xù)入選北京大學第三醫(yī)院健康育齡女性49例，健康孕婦39例，PE孕婦34例。PE診斷符合《妊娠期高血壓疾病診治指南（2020）》診斷標準［10］。排除患有妊娠期高血壓、慢性高血壓、心臟病、糖尿病、自身免疫病、闌尾炎、膽囊炎和胰腺炎等疾病的患者。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準（批準文號：IRB00006761），研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 掃描電子顯微鏡（日本電子公司）；大容量臺式離心機（美國Thermo FIsher Scientific公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），CantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司）；共聚焦培養(yǎng)皿（美國MatTek公司）。

I型膠原、凝血酶、Gly-Pro-Arg-Pro amide（GPRP）、PBS緩沖液、前列腺素E1（美國Sigma公司）；流式細胞管、FITC-Annexin V、PE-Cy7 CD41a抗體、PE-Cy7 IgG1κ同型對照（美國BD公司）；PE-CD62P抗體、PE-CD62P IgG1κ同型對照（美國Biolegend公司）；Cy5-GSAO、Cy5-GSCA（北京博奧森公司）；PGE1（美國MCE公司）。

1.3 體外激活血小板成為促凝血小板的反應條件 采集5名健康育齡女性志愿者新鮮全血，在室溫條件下，即刻分別用不同濃度的膠原（2、5、10、12及15μg/mL）和凝血酶（0.1、0.2、0.5、1、2 U/mL）激活血小板（終濃度：2×109/mL），以確定體外激活血小板形成促凝血小板的適宜反應條件。

1.4 利用掃描電鏡檢測促凝血小板形成 采集新鮮全血，0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝（抗凝劑∶全血＝1∶9），在室溫、230×g條件下離心5 min，獲取富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP），將PRP加入包被有膠原及凝血酶的共聚焦培養(yǎng)皿溫育60 min，洗滌及干燥處理后于電鏡下觀察。

1.5 利用流式細胞術(shù)構(gòu)建促凝血小板檢測方法

1.5.1 采用全血作為樣本檢測促凝血小板 即刻檢測枸櫞酸鈉抗凝血：設置同型對照管、CD41a單陽管、CD62P單陽管、GSAO單陽管，每份血小板分為靜息組、激活處理2個組。除靜息組外，分別向各管加入激活劑及相應熒光抗體，室溫溫育15 min后洗滌，上機檢測。設門方案：首先，調(diào)節(jié)流式細胞儀電壓及補償，在FSC-SSC圖中圈定血小板大小所在位置，見圖1A中P1區(qū)域；其次，利用血小板特異表達CD41a圈出血小板，圖1B中P2區(qū)域；最后，通過PE-CD62P和Cy5-GSAO圈定血小板促凝亞群，見圖1C中Q2區(qū)域。

1.5.2 采用洗滌血小板作為樣本檢測促凝血小板 室溫條件下，枸櫞酸鈉抗凝血中加入前列腺素E1，離心（230×g，7 min）獲得PRP，再次離心（300×g，5 min）獲得血小板。洗滌血小板的染色處理程序、設門方案同上述全血，見圖1D～1F。

圖1 利用流式細胞術(shù)構(gòu)建促凝血小板檢測方法

1.5.3 檢測所構(gòu)建促凝血小板檢測方法的精密度 采集一名健康育齡女性志愿者靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉抗凝，利用上述構(gòu)建的2種方法連續(xù)測定5次，計算變異系數(shù)（coefficient variation，CV）。

1.6 研究對象血小板激活成為促凝血小板的比例 采集研究對象靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝，用1.5方法檢測研究對象血小板激活成為促凝血小板的比例并分析。

1.7 統(tǒng)計學分析 分別用SPSS 20.0和Graphpad prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析和繪圖。流式細胞術(shù)檢測促凝血小板的精密度評價以CV表示。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用±s表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用M（P25，P75）表示，采用Kruskal-WallisH檢驗進行多組間比較。促凝血小板對PE的鑒別效能用ROC曲線分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體外激活血小板成為促凝血小板的反應條件 在2～15μg/mL膠原濃度范圍內(nèi)和在0.1～2 U/mL凝血酶濃度范圍內(nèi)，血小板激活成促凝血小板的比例都逐漸升高，見圖2；用15μg/mL膠原和2 U/mL凝血酶聯(lián)合激活產(chǎn)生的促凝血小板水平高于2種激活劑單獨激活時水平，見表1。為了使流式細胞術(shù)構(gòu)建的促凝血小板檢測方法具有足夠精密度，選擇15μg/mL膠原和2 U/mL凝血酶聯(lián)合激活，作為體外檢測血小板激活形成促凝血小板能力的激活條件。

圖2 不同濃度膠原和凝血酶激活血小板成為促凝血小板的水平

表1 不同誘導劑誘導血小板成為促凝血小板亞群的比例（n＝5）

2.2 掃描電鏡下血小板激活后的形態(tài) 見圖3。用15μg/mL膠原及2 U/mL凝血酶作為激活劑，在體外激活健康育齡女性的血小板，在掃描電鏡下可以觀察到3種不同形態(tài)的血小板，分別為靜息血小板、聚集血小板亞群和促凝血小板亞群。

圖3 掃描電鏡下血小板激活后的形態(tài)

2.3 流式細胞術(shù)檢測促凝血小板精密度驗證 利用全血在靜息、激活狀態(tài)下檢測促凝血小板的精密度分別為10.11%和3.13%；利用洗滌血小板在靜息和激活狀態(tài)下檢測促凝血小板的精密度分別為12.86%和6.75%。見表2。

表2 利用流式細胞術(shù)構(gòu)建促凝血小板檢測方法的精密度（n＝5）

2.4 研究對象人口學特征及臨床資料 研究對象人口學特征和臨床資料見表3，3組間年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；PE組和健康妊娠組懷孕期間增加體重、孕次、產(chǎn)次和孕周差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。計學意義［5.25%（4.13%，6.30%）vs 4.30%（3.70%，5.50%），P＝0.152］；血小板被激活后，PE孕婦組促凝血小板水平也高于健康育齡女性組［19.25%（15.98%，24.08%）vs 13.20%（11.55%，15.70%），P＜0.001］和健康妊娠孕婦組［19.25%（15.98%，24.08%）vs 16.50%（15.00%，17.50%），P＝0.047］。

表3 研究對象人口學特征及臨床資料

進行ROC分析顯示，采用全血樣本，在靜息狀態(tài)下，ROC曲線下面積（AUCROC）為0.951（0.908～0.994），當cut-off值為1.65%時，區(qū)分健康孕婦和PE的敏感性和特異性分別為97.1%和84.6%；在激活狀態(tài)下，AUCROC為0.993（0.978～1.000），當cut-off值為12.35%時，區(qū)分健康孕婦和PE的敏感性和特異性分別為100.0%和97.4%；而洗滌血小板在激活狀態(tài)下，AUCROC為0.691（0.563～0.819），當cut-off值為18.25%時，區(qū)分健康孕婦和PE的敏感性和特異性分別為61.8%和76.9%，見圖4。

圖4 采用不同樣本類型檢測促凝血小板區(qū)分正常妊娠和PE的性能

2.5 各組研究對象血小板激活成為促凝血小板比例的差異比較 采用全血作為檢測樣本，血小板在靜息狀態(tài)下，PE孕婦組促凝血小板水平高于健康妊娠女性組［2.30%（1.90%，2.80%）vs 1.35%（1.13%，1.50%），P＜0.001］和健康育齡女性組［2.30%（1.90%，2.80%）vs 0.30%（0.20%，0.60%），P＜0.001］；血小板被激活后，PE孕婦組促凝血小板水平也高于健康妊娠女性組［16.90%（15.25%，18.85%）vs 8.50%（7.92%，9.50%），P＜0.001］和健康育齡女性組［16.90%（15.25%，18.85%）vs 3.70%（2.95%，4.30%），P＜0.001］。

采用洗滌血小板作為檢測樣本，血小板在靜息狀態(tài)，PE孕婦組促凝血小板水平高于健康育齡女性組［5.25%（4.13%，6.30%）vs 2.50%（2.20%，2.90%），P＜0.001］，但與健康妊娠女性組差異無統(tǒng)

3 討論

本研究利用流式細胞術(shù)成功構(gòu)建了可靠的促凝血小板檢測方法，并且對入組的健康育齡女性、健康妊娠孕婦和PE孕婦進行了促凝血小板檢測，結(jié)果提示PE孕婦血小板激活后成為促凝血小板水平顯著高于健康妊娠孕婦。

3.1 基于促凝血小板是血小板的一種死亡方式構(gòu)建促凝血小板檢測方案 細胞在經(jīng)歷壞死過程時，其線粒體膜上的mPTP的開放，隨后細胞內(nèi)部形成超高的Ca2+流，與細胞壞死過程相似，血小板促凝亞群的形成過程中同樣伴隨mPTP的開放以及細胞內(nèi)部的超高Ca2+流［9-13］；除此之外，在電子顯微鏡下觀察到血小板促凝亞群的關(guān)鍵形態(tài)特征類似于哺乳動物有核細胞所表現(xiàn)的壞死特征，例如，細胞膜上PS轉(zhuǎn)移至細胞膜外側(cè)，細胞微泡化以及細胞膜完整性喪失［14］。所以，血小板促凝亞群是經(jīng)歷壞死過程的血小板。4-（N-（S-谷胱甘肽乙?；┌被┍诫纤幔?-（N-（S-glutathionylacetyl）amino）phenylarsonous acid，GSAO］是細胞壞死的標志物，研究人員在GSAO的γ-谷氨酰基殘基上標記熒光報告基團，利用它作為標志物成功檢測到了血小板促凝亞群［15-19］。

除去壞死特征，血小板促凝亞群也是激活的血小板。血小板受到激活劑刺激后，CD62P大量轉(zhuǎn)移至血小板膜上，是血小板激活的標志物［20］。因此，本研究采用CD62P以及GSAO同時定義血小板促凝亞群，成功利用全血和洗滌血小板作為樣本構(gòu)建了血小板促凝亞群的檢測方案。

3.2 PE的炎癥反應狀態(tài)可能導致血小板在體內(nèi)預激活 本研究結(jié)果顯示，PE孕婦的促凝血小板水平均顯著高于健康妊娠孕婦，這可能是由于PE孕婦存在更高的炎癥反應狀態(tài)，容易導致靜息血小板在體內(nèi)預激活。

促凝血小板形成的前提是胞漿Ca2+水平持續(xù)升高，當血小板處于高炎癥環(huán)境時，促炎癥因子（如腫瘤壞死因子α）、黏附分子等增加，可通過復雜的機制導致血小板胞漿Ca2+升高，即血小板在炎癥狀態(tài)下可能被預激活，在受到激活刺激后就會更容易形成形成促凝血小板［21］。這與本研究結(jié)果一致：利用全血在靜息狀態(tài)下檢測的PE孕婦血小板促凝亞群水平顯著高于健康妊娠孕婦［2.30%（1.90%，2.80%）vs 1.35%（1.13%，1.50%），P＜0.001］（洗滌血小板可能由于樣品制備過程因素導致組間無差異）；在利用激活劑激活后，利用全血以及洗滌血小板作為樣本，PE組的血小板促凝亞群水平自然也均顯著高于健康妊娠孕婦組［16.90%（15.25%，18.85%）vs 8.50%（7.92%，9.50%），P＜0.001；19.25%（15.98%，24.08%）vs 16.50%（15.00%，17.50%），P＝0.047］。

3.3 促凝血小板檢測采用全血方案優(yōu)于洗滌血小板方案的原因 本研究結(jié)果顯示，采用全血檢測方案在檢測精密度和區(qū)分PE孕婦與健康妊娠孕婦時都顯示了優(yōu)越性。

首先，全血方案的樣本處理程序簡單導致檢測的變異因素少。利用全血在靜息、激活狀態(tài)下檢測促凝血小板的精密度分別為10.11%和3.13%；而利用洗滌血小板在靜息和激活狀態(tài)下檢測促凝血小板的精密度分別為12.86%和6.75%，提示采用洗滌血小板可能因為多次離心、洗滌導致檢測過程中影響因素增多，導致了檢測不確定度增加。

其次，血小板洗滌程序可能外源性增加了血小板的預激活程度，使PE組和健康妊娠組的差異縮小，區(qū)分PE孕婦和健康孕婦的能力下降。利用全血作為樣本，健康妊娠孕婦和PE孕婦的比較無論在靜息［1.35%（1.13%，1.50%）vs 2.30%（1.90%，2.80%），P＜0.001］或是激活狀態(tài)［8.50%（7.92%，9.50%）vs 16.90%（15.25%，18.85%），P＜0.001］差異均有統(tǒng)計學意義；而利用洗滌血小板進行檢測，只有在激活狀態(tài)下，PE的促凝血小板水平顯著高于健康妊娠孕婦［19.25%（15.98%，24.08%）vs 16.50%（15.00%，17.50%），P＝0.047］，且差異程度不及采用全血樣本顯著；并且靜息狀態(tài)下兩組沒有差異［5.25%（4.13%，6.30%）vs 4.30%（3.70%，5.50%），P＝0.152］，這提示洗滌血小板的制備過程中可能導致了血小板預激活，使原本差異小的靜息狀態(tài)下的差異消失，激活狀態(tài)下的差異變小。ROC曲線分析顯示，用全血檢測，在靜息和激活狀態(tài)下檢測促凝血小板區(qū)分PE和健康妊娠的AUCROC分別為0.951和0.993；而利用洗滌血小板檢測，在激活狀態(tài)下，其ROCROC只有0.691，這表明采用全血檢測的區(qū)分PE孕婦和健康孕婦的能力明顯好于洗滌血小板。

綜上所述，利用流式細胞術(shù)成功構(gòu)建促凝血小板檢測方法，其中采用全血檢測的方案性能優(yōu)于洗滌血小板檢測方案。PE孕婦促凝血小板形成水平顯著高于健康妊娠孕婦，提示促凝血小板可能參與PE發(fā)生。