不同基質(zhì)類型維生素K檢測結(jié)果分析

賈永娟，劉春冉，李婷，倪君君（北京和合醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)股份有限公司研究院，北京 100079）

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的天然維生素K有2種：維生素K1和維生素K2。維生素K1主要來源于綠色植物，而維生素K2主要在體內(nèi)通過腸道細(xì)菌合成［1］。維生素K2的主要生理活性以MK4和MK7 2種形式為主，可以在人體內(nèi)直接發(fā)揮生理作用，而維生素K1必須通過生物轉(zhuǎn)化為維生素K2才能夠發(fā)揮生理作用。維生素K與機(jī)體健康密切相關(guān)，不僅在機(jī)體抗凝系統(tǒng)中扮演重要角色［2］，還參與調(diào)節(jié)骨代謝［3］、血管鈣化和心血管疾病的診斷與治療［4］、糖代謝、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、癌癥及腫瘤的治療與預(yù)防等［5-7］。人體內(nèi)維生素K主要活性成分的監(jiān)測對人體健康有著極為重要的意義，特別是嬰幼兒和新生兒維生素K水平受到越來越多的關(guān)注和重視［8］。目前維生素K含量測定的樣本類型主要是血清［9］和血漿［10］，而指尖血相對于血清和血漿更易獲得且對患者創(chuàng)傷更小。本研究比較了指尖血、血清和血漿3種基質(zhì)維生素K1、MK4和MK7檢測結(jié)果的差異，為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢測維生素K1、MK4和MK7時(shí)選擇樣本基質(zhì)提供指導(dǎo)和參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 分別采集30名健康志愿者指尖血100μL，分別采集靜脈血并制備新鮮血清、血漿標(biāo)本各1 mL，排除溶血、脂血、黃疸標(biāo)本。30名健康志愿者來自本單位，年齡25～45周歲，未服用維生素K制劑，體檢結(jié)果正常，對本研究知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 島津LC-30ADCL高效液相色譜儀、島津8050C串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（日本島津公司），MSA 6.6S-0CE-DM電子天平、A-14C-1EU YCSR-A2B離心機(jī)（德國賽多利斯公司）；甲醇、甲酸、無水乙醇（德國默克公司），乙腈、異丙醇、環(huán)己烷（美國Fishier公司），Oasis?HLB SPE板（美國Waters公司），維生素K1、MK4、MK7標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)（美國Sigma公司）。天平精密稱取維生素K1、MK4、MK7標(biāo)準(zhǔn)品，并用乙腈溶解稀釋后得到3種物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度范圍分別為維生素K1：0.015～250.000 ng/mL，MK4：0.015～15.000 ng/mL，MK7：0.015～30.000 ng/mL；天平精密稱取維生素K1、MK4、MK7內(nèi)標(biāo)，并用乙腈溶解稀釋后得到3種物質(zhì)混合內(nèi)標(biāo)溶液，濃度分別為50 ng/mL、15 ng/mL、15 ng/mL。

1.3 方法 本實(shí)驗(yàn)室自建方法。精密移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液或人指尖血、血清、血漿各50μL于離心管中，加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液，充分混勻1 min；加入無水乙醇150μL，渦旋3 min，4℃14 462×g離心10 min，取上清液于Oasis?HLB SPE板，分別用300μL由甲醇和水（含0.5%甲酸）按2∶8比例配制的溶液、300μL乙腈和水（含0.5%甲酸）按9∶1配制的溶液洗滌SPE板，最用500μL由甲醇、異丙醇、環(huán)己烷按1∶1∶3比例配制的溶液進(jìn)行洗脫，室溫下氮?dú)獯蹈上疵撘?，最后加?0μL甲醇復(fù)溶，渦旋震蕩1 min，4℃14 462×g離心3 min，取上清液60μL進(jìn)樣分析；色譜柱：Agilent Eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8μm）；流動(dòng)相：甲醇（0.1%甲酸）/水（0.1%甲酸），梯度洗脫；質(zhì)譜條件：APCI源，用自動(dòng)優(yōu)化軟件對維生素K1、MK4、MK7進(jìn)行優(yōu)化得出3種物質(zhì)最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)（離子源溫度：300℃、DL管溫度：300℃、霧化氣流速：2.5L/min、接口電壓：6kV）。每個(gè)基質(zhì)類型分別檢測維生素K1、MK4、MK7含量，每份樣本檢測2次。

參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）C62-A文件《高效液相色譜質(zhì)譜檢測方法指導(dǎo)原則》，對自建方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，包括回收率、基質(zhì)效應(yīng)、精密度、定量限、檢出限等，以確保檢測方法的準(zhǔn)確性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證 參照C62-A對自建方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，在3種基質(zhì)中維生素K1、MK4、MK7的回收率在90%～115%之間，基質(zhì)效應(yīng)在4.96%～5.69%之間，精密度以CV表示，均小于6.25%，檢出限和定量限遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于定量下限，具體結(jié)果見表1。

表1 自建方法檢驗(yàn)維生素K1、MK4、MK7的方法學(xué)考察結(jié)果

2.2 不同基質(zhì)樣本K1、MK4、MK7水平 3種不同基質(zhì)中維生素K1、MK4、MK7的檢測結(jié)果見表2。3種不同基質(zhì)中維生素K1、MK4、MK7檢測結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 3種不同基質(zhì)中維生素K1、MK4、MK7的檢測結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)果表明，指尖血、血清和血漿3種不同基質(zhì)用于維生素K1、MK4和MK7含量檢測，其結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。指尖血采集比通過靜脈穿刺采血更加容易，同時(shí)患者對這種形式的采血恐懼心理更小，護(hù)理人員的采血壓力也更小，但是在采集指尖血時(shí)要特別注意，采血中不可用力擠壓，以免組織液混入血液，使血液易于凝固和稀釋，從而導(dǎo)致測定結(jié)果出現(xiàn)誤差。

本研究從實(shí)際臨床需要出發(fā)，為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢測維生素K含量提供了參考和依據(jù)。必須指出的是，本研究結(jié)果可能會受健康志愿者年齡、身體狀況、檢測方法等諸多因素的影響，本研究征集的30名健康志愿者是年齡在25～45周歲的健康人，采用的是LC-MS/MS方法，因此本研究得出的結(jié)論還需要在更多不同人群和其他檢測手段中進(jìn)一步驗(yàn)證。