血清總膽紅素改良參考測量程序的復(fù)現(xiàn)及性能評價

李敏，孟祥兆，孫江漫，邵燕，于洪遠(yuǎn)（北京航天總醫(yī)院檢驗科，北京 100076）

總膽紅素是醫(yī)學(xué)實驗室肝功能檢查的重要常規(guī)項目，其結(jié)果有助于臨床醫(yī)生判斷患者肝臟功能、黃疸程度及類型等［1］。Doumas等開發(fā)的檢測總膽紅素的參考方法已獲得國際認(rèn)可，該方法建議使用NIST的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM916a作為一級參考物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)。目前，SRM916a已經(jīng)停產(chǎn)，這種狀態(tài)阻礙了總膽紅素的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程。德國漢諾威臨床化學(xué)研究所在Doumas參考方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，改良參考測量程序不再依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)。本研究通過復(fù)現(xiàn)血清總膽紅素的改良參考測量程序，并對其各項性能進(jìn)行評估，觀察其是否可實現(xiàn)臨床常規(guī)實驗室總膽紅素檢測結(jié)果的量值溯源和標(biāo)準(zhǔn)化。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 Cary100紫外-可見分光光度計（安捷倫公司），LA120S型電子天平（賽多利斯公司），reference移液器（艾本德公司），Microlab-500型稀釋配液儀（Hamilton公司），Milli-Q純水機(jī)（密理博公司）。

對氨基苯磺酸（批號：BCBJ0170V）、亞硝酸鈉（批 號：1389022）、四 水 酒 石 酸 鉀 納（批 號：SLBD8827V）、氫氧化鈉（批號：BCBH5016）、安息香酸鈉（批 號：SLBC8803V）、EDTA-Na2（批 號：1205337）、醋酸鈉（批號：SZBF2210V）（Sigma公司），咖啡因（批號：007913275）購自（AMRESCO公司）。

1.2 標(biāo)本來源 （1）2020年國際參考實驗室比對標(biāo)本20RELA-A、20RELA-B，合格范圍分別為（53.50±2.94）μmol/L、（22.43±1.23）μmol/L，膽紅素國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW09184、GBW09185（有效期2021年12月），靶值±不確定度范圍分別為（108.10±1.9）μmol/L、（44.60±0.8）μmol/L（k＝2），均用于方法的正確度評價；（2）收集北京航天總醫(yī)院住院患者血清，無肉眼可見的溶血和乳糜，用于方法的精密度和線性評價。

1.3 方法

1.3.1 反應(yīng)原理 在咖啡因試劑的存在下，膽紅素與重氮試劑反應(yīng)生成偶氮膽紅素，酸性條件下呈紅色，堿性酒石酸使顏色不穩(wěn)定的紫紅色偶氮膽紅素轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的藍(lán)色偶氮膽紅素，最大吸收峰由530 nm轉(zhuǎn)移至598 nm，該波長下偶氮化合物的吸光度與膽紅素濃度呈正比。

1.3.2 試劑配制與檢測 依據(jù)參考文獻(xiàn)［2］中的內(nèi)容配制相關(guān)試劑，包括咖啡因試劑、堿性酒石酸、亞硝酸鈉溶液、對氨基苯磺酸溶液、重氮試劑。實驗室測量條件：溫度25℃；波長598 nm；光譜帶寬2 nm；光徑10.0 mm。具體檢測步驟如下：1 mL的咖啡因試劑和0.2 mL的待測標(biāo)本同時加入測量管和空白管，室溫下充分混勻，靜置10 min。測量管和空白管中分別加入0.5 mL的重氮試劑和對氨基苯磺酸，室溫下充分混勻，靜置10 min。最后，測試管和空白管中均加入1 mL的堿性酒石酸，室溫下充分混勻，靜置10 min后在598 nm處檢測吸光度。

1.3.3 測量結(jié)果的計算 血清總膽紅素含量是由空白吸光度修正后的最終反應(yīng)混合物的吸光度總和乘以因子F計算得出，具體公式見公式1。

式中ε為摩爾吸光系數(shù)（7 649 m2/mol）［3］，d為比色杯光徑（0.01 m），v為樣本的體積分?jǐn)?shù)（0.074 04），f為mol/m3到μmol/L的單位轉(zhuǎn)換系數(shù)（1 000），Atotal為最終完全反應(yīng)混合物在598 nm處的吸光度，Ablank為空白溶液在598 nm處的吸光度，經(jīng)計算F因子＝176.5?？瞻坠芘c測量管相比，除了用對氨基苯磺酸代替重氮試劑，其他添加試劑和反應(yīng)條件均相同。

1.4 性能評價

1.4.1 正確度 采用改良的參考測量程序檢測國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和RELA比對標(biāo)本，每個標(biāo)本重復(fù)測量3次，計算平均值，比較均值與靶值/認(rèn)定值的偏倚。

1.4.2 精密度 取3份不同濃度梯度的血清標(biāo)本，每天每個濃度標(biāo)本測量5次，連續(xù)測量5 d，各25個檢測結(jié)果，計算總CV。

1.4.3 線性 參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所的EP-6A文件，收集本院高值（H）膽紅素血清樣本，低值（L）血清樣本，按L、0.8L+0.2H、0.6L+0.4H、0.4L+0.6H、0.2L+0.8H、H的比例配制6個濃度標(biāo)本，按隨機(jī)順序?qū)γ總€濃度的標(biāo)本進(jìn)行測定，重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合多項式回歸分析。

1.4.4 不確定度 根據(jù)《測量不確定度表示指南》，識別測量結(jié)果各不確定度分量來源，對各分量分別進(jìn)行評定，計算相對擴(kuò)展不確定度。

1.4.5 方法學(xué)比對 采用改良參考測量程序和Doumas方法測定40份新鮮冰凍人血清標(biāo)本中的總膽紅素，濃度范圍為10～240μmol/L，選取最佳擬合模型進(jìn)行回歸分析，計算回歸方程及各項參數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件和Microsoft Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 正確度評價 改良參考測量程序?qū)?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和RELA樣本的檢測結(jié)果見表1，所有測量值均在合格范圍內(nèi)，偏倚均小于1.5%。

表1 總膽紅素正確度評價結(jié)果

2.2 精密度評價 3個濃度水平的血清標(biāo)本連續(xù)測量5 d結(jié)果的總CV均小于1.5%，見表2。

表2 總膽紅素精密度評價結(jié)果

2.3 線性評價 使用改良的參考測量程序檢測6個濃度梯度的標(biāo)本，結(jié)果見表3。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多項式回歸分析處理。通過對結(jié)果分析可知，二次和三次回歸多項式中的非線性參數(shù)與0相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），實驗數(shù)據(jù)最適擬合模型為一次多項式，總膽紅素在11.55～443.96μmol/L的范圍內(nèi)呈線性。

表3 總膽紅素線性評價測量結(jié)果

2.4 不確定度評價 建立評定總膽紅素測量不確定度的模型，見公式1。識別不確定度來源，考慮影響測量結(jié)果的所有因素，將其繪制成因果關(guān)系圖，見圖1。識別不確定度來源后，量化這些不確定度來源所產(chǎn)生的不確定度分量。經(jīng)分析，波長、吸光度、測量溫度、延遲時間、樣本體積分?jǐn)?shù)等是影響總膽紅素測量不確定度的主要分量。通過對不確定度分量的合成，計算合成不確定度及相對擴(kuò)展不確定度，見表4。

表4 不確定度評價結(jié)果

圖1 不確定度來源的因果關(guān)系圖

2.5 方法學(xué)比對 以Doumas參考方法的測定結(jié)果為X軸，改良參考測量程序的測定結(jié)果為Y軸，對兩種方法采用Passing-Bablok回歸分析。線性回歸方程為Y＝0.029 9+1.001X，斜率的95%CI為0.995 8～1.004 6，截距的95%CI為-0.197 2～0.187 5，相關(guān)系數(shù)r＝0.999，回歸線顯示斜率與1、截距與0無顯著偏差，因此兩種方法測量結(jié)果之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

雖然總膽紅素的Doumas參考方法已獲得美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）的批準(zhǔn)，但是官方認(rèn)可的總膽紅素參考測量實驗室網(wǎng)絡(luò)仍然缺失，其中很大的原因是由于NIST提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM916a無法持續(xù)供應(yīng)。因此，避免使用916a進(jìn)行校準(zhǔn)，有利于優(yōu)化測量程序的性能并消除相關(guān)的不確定度因素。

本研究依據(jù)相關(guān)文件復(fù)現(xiàn)總膽紅素改良參考測量程序，與傳統(tǒng)的Doumas參考方法相比有以下幾點不同：（1）使用摩爾吸光系數(shù)代替標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)，無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)典的Doumas參考方法的難點之一是標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，用NIST916a配制200 mg/L總膽紅素標(biāo)準(zhǔn)原液并在598 nm處測定摩爾吸光系數(shù)ε，若ε滿足證書要求，則可以將原液稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Lo等［4］的總膽紅素室間比對表明使用摩爾吸光系數(shù)代替標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)，有助于推動總膽紅素測量標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程。（2）樣本量從0.5 mL減少到0.2 mL，最終反應(yīng)混合物的體積從8.5 mL減少到2.7 mL，有利于小體積患者標(biāo)本的測量。（3）傳統(tǒng)方法對總膽紅素的測量上限為261μmol/L，改良后的程序提供了更高的測量范圍，經(jīng)實驗數(shù)據(jù)驗證，測量上限可達(dá)443.96μmol/L。（4）不確定度分量的來源發(fā)生變化。Doumas參考方法中校準(zhǔn)曲線斜率和截距、標(biāo)準(zhǔn)原液的配制是主要的不確定度分量來源，改良后的參考測量程序消除了校準(zhǔn)曲線引入的不確定度分量。

對于改良參考測量程序，本研究未對可能的干擾因素進(jìn)行研究，如標(biāo)本中血紅蛋白濃度、鋅的濃度、光照強(qiáng)度的影響等，我們將在后續(xù)的實驗中及時補(bǔ)充相關(guān)數(shù)據(jù)。