估算法和測(cè)量法在血清殘余脂蛋白膽固醇評(píng)估中的比較

黃本林，王寧，王妮，冷麗，朱星成（曲靖市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南曲靖 655000）

血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）形成的核心因素。低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoproteins cholesterol，LDL-C）作為“壞膽固醇”，向來被認(rèn)為是致As的罪魁禍?zhǔn)祝?］。因此，過去幾十年中，集中于降低LDL-C水平的調(diào)脂策略成為預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化性心血管?。╝therosclerotic cardiovascular disease，AsCVD）的基石［2］。然而，研究也發(fā)現(xiàn)，將LDL-C降至推薦濃度后，再次發(fā)生心血管事件的殘留風(fēng)險(xiǎn)仍然很高［3-5］。很多研究致力于發(fā)掘殘留風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物，殘余脂蛋白膽固醇（remnant lipoprotein cholesterol，RLP-C）即是其一。目前主流觀念將RLP-C定義為富含三酰甘油（triglyceride，TG）的膽固醇［6］，其由空腹?fàn)顟B(tài)下的極低密度脂蛋白膽固醇（very low-density lipoproteins cholesterol，VLDL-C）和中間密度脂蛋白膽固醇（intermediatedensity lipoproteins cholesterol，IDL-C）或非空腹?fàn)顟B(tài)下的VLDL-C、IDL-C和乳糜微粒殘余物組成。研究表明，獨(dú)立于升高的LDL-C和降低的HDL-C，RLP-C的增加與AsCVD的風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)［7-9］。巨噬細(xì)胞通過識(shí)別RLP-C表面的載脂蛋白E觸發(fā)脂蛋白攝取［10］，故RLP-C不需要氧化修飾即被巨噬細(xì)胞攝?。?1］。此外，炎癥介導(dǎo)了As的進(jìn)展，Verbo等［12］研究發(fā)現(xiàn)RLP-C的增加與低度炎癥和缺血性心臟病有因果關(guān)系，而LDL-C與此無關(guān)。

既往研究中評(píng)估RLP-C水平采用的方法主要分為兩大類：測(cè)量法和估算法。測(cè)量法主要有免疫分離法［13］、超速離心法［14-15］、ELISA法［16］、硫代巴比妥酸反應(yīng)法［17］等。然而，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于RLP-C定量測(cè)量法的研究較少。因成本低、操作方便，估算法在臨床實(shí)踐和研究中逐漸得到推廣和應(yīng)用。Varbo等［7］開展的多項(xiàng)研究采用了由Friedewald方程［18-19］計(jì)算的VLDL-C來近似估算RLP-C。測(cè)量法與估算法一致性評(píng)價(jià)尚未見報(bào)道，本研究采用Bland-Altman法和組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（intraclass correlation efficient，ICC）法分析RLP-C酶法與Friedewald方程估算法的一致性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年1月至2020年3月就診于我院心臟內(nèi)科、糖尿病科和內(nèi)分泌科的671例AsCVD患者和同時(shí)期325例無AsCVD患者為研究對(duì)象。本研究獲得入選研究對(duì)象的知情同意，臨床資料收集和數(shù)據(jù)分析時(shí)，對(duì)相關(guān)信息進(jìn)行保密處理。

1.2 主要儀器與試劑 TC測(cè)定采用膽固醇氧化酶法，TG測(cè)定采用酶比色法，HDL-C測(cè)定采用均相酶比色法，LDL-C測(cè)定采用均相酶比色法，以上檢測(cè)指標(biāo)所用試劑均購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷公司。RLP-C測(cè)定采用表面活性劑清除法，所用試劑購(gòu)自上海潤(rùn)鴻公司。以上指標(biāo)均在羅氏cobas8000 c701全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)，并已進(jìn)行校準(zhǔn)，確保質(zhì)控在控。

1.3 標(biāo)本采集與處理 采集靜脈血2 mL，收集于非抗凝的真空采血管中，常溫條件下快速離心分離血清（4 390×g，10 min），并保存于-80℃冰箱。避免收集溶血、脂血、黃疸等有干擾的標(biāo)本。

1.4 RLP-C測(cè)量法與估算法 RLP-C定量測(cè)量法的反應(yīng)原理：（1）試劑中的表面活性劑和磷脂酶D協(xié)同作用，選擇性地修飾殘粒樣脂蛋白（RLPs），使其溶于反應(yīng)體系中，形成溶解態(tài)的殘粒樣脂蛋白，同時(shí)屏蔽其他脂蛋白使其不溶于反應(yīng)體系中。（2）溶解態(tài)殘粒樣脂蛋白中的膽固醇酯（RLP-C ester）經(jīng)膽固醇酯酶水解，形成游離膽固醇。（3）生成的游離膽固醇在膽固醇氧化酶的作用下，生成膽甾烯酮和雙氧水，并經(jīng)Trinder反應(yīng)產(chǎn)生色源顯色。整個(gè)反應(yīng)過程中，經(jīng)表面活性劑、磷脂酶D和膽固醇酯酶等多種酶的共同作用，將RLPs以外的其他脂蛋白排除（見圖1）。

圖1 表面活性劑清除法檢測(cè)血清RLP-C原理

RLP-C估算值（Friedewald-estimated RLP-C，RLP-Ce）根據(jù)Friedewald方程得出，RLP-Ce＝TCHDL-C-LDL-C。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24、Microsoft Excel 2016及R 2.6.2軟件整理數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析和作圖。正態(tài)分布計(jì)量資料的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)用r表示。非正態(tài)分布計(jì)量資料的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)用rs表示。分別采用Bland-Altman法和ICC法對(duì)RLP-Ce與RLP-Cm的一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 RLP-C測(cè)量值與估算值的相關(guān)性 以RLP-Ce為X，RLP-Cm為Y繪制散點(diǎn)圖（圖2），顯示隨著RLP-Ce水平上升，RLP-Cm濃度也隨之升高，二者存在正相關(guān)關(guān)系（r＝0.4，P＜0.001）。以RLP-Ce為X，以RLP-Ce與RLP-Cm之差為Y繪制的散點(diǎn)圖顯示隨著RLP-Ce水平升高，RLP-Ce與RLP-Cm之間的差異越來越大（見圖3）。

圖2 RLP-C測(cè)量值與估算值相關(guān)性

圖3 RLP-C估算值與RLP-Ce和RLP-Cm差值的相關(guān)性

2.2 不同TG水平下脂蛋白膽固醇的構(gòu)成差異 各脂蛋白膽固醇組分的相關(guān)性矩陣見圖4。RLP-Cm與HDL-C之間呈負(fù)相關(guān)（rs＝-0.2，P＜0.001），與LDL-C、TC、non-HDL-C以及TG均存在正相關(guān)關(guān)系，rs分別為0.13、0.25、0.3和0.53（P＜0.001）。結(jié)果還提示，對(duì)比所有膽固醇成分，RLP-Ce、RLP-Cm與TG之間的相關(guān)性最高（rs分別為0.64和0.53，P＜0.001），而RLP-Cm與RLP-Ce之間的相關(guān)性較弱（rs＝0.4，P＜0.001）。

圖4 各脂蛋白膽固醇組分之間的相關(guān)性

進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，總體情況下（n＝996），隨著TG濃度逐漸升高，HDL-C呈下降趨勢(shì)，LDL-C水平變化不大，RLP-Ce和RLP-Cm均隨之遞增（圖5）。當(dāng)TG＜1 mmol/L時(shí)，RLP-Cm的平均濃度為0.22 mmol/L，占RLP-Ce的81%；在其他水平下（TG分別為1～1.99、2～2.99、3～3.99、4～4.99及≥5 mmol/L），RLP-Cm平均濃度分別為0.26、0.36、0.49、0.59和0.86 mmol/L，但RLP-Cm/RLP-Ce比值逐漸減小，分別為62%、51%、54%、46%和45%。

圖5 不同TG水平下脂蛋白膽固醇的構(gòu)成情況

2.3 RLP-C測(cè)量法與估算法的一致性評(píng)價(jià) Bland-Altman法的結(jié)果見圖6，對(duì)所有研究對(duì)象（n＝996），7.0%（70/996）位于95%一致性界限（95%limits of agreement，95%LoA）外，RLP-C估算法的平均陽性偏倚為0.2 mmol/L（95%CI：0.18～0.23）。ICC法的結(jié)果顯示，ICC＝0.551［（95%CI：0.192～0.732），P＜0.001］。上述兩種方法均表明RLP-C測(cè)定法與估算法一致性欠佳。

圖6 測(cè)量法與RLP-C估算法一致性評(píng)價(jià)的Bland-Altman圖

3 討論

研究表明，作為脂蛋白代謝中的重要部分，升高的血清RLP-C能解釋AsCVD患者降LDL-C治療達(dá)標(biāo)情況下再次發(fā)生心血管意外的殘留風(fēng)險(xiǎn)［4］。丹麥哥本哈根大學(xué)的Varbo等［7］發(fā)現(xiàn)，獨(dú)立于降低的HDL-C，非空腹RLP-C濃度每增加1 mmol/L（39 mg/dL），相應(yīng)的缺血性心臟病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上升2.8倍。研究還發(fā)現(xiàn)，既往診斷為心肌梗死或缺血性中風(fēng)的患者，其血清RLP-C每降低0.8 mmol/L（32 mg/dL），二級(jí)預(yù)防中再次出現(xiàn)心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)降低20%［20］。由As發(fā)展到出現(xiàn)明顯臨床癥狀往往需要經(jīng)歷幾十年，及早識(shí)別危險(xiǎn)因素、針對(duì)危險(xiǎn)因素采取有效的應(yīng)對(duì)措施是降低AsCVD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)最重要的方面。所以，AsCVD的一級(jí)預(yù)防和二級(jí)預(yù)防可能不僅僅只關(guān)注降LDL-C治療。

目前，主流觀念將RLP-C定義［6］為富含TG的膽固醇，由空腹?fàn)顟B(tài)下的VLDL-C和IDL-C或非空腹?fàn)顟B(tài)下的VLDL、IDL和乳糜殘余物組成。由于其代謝特點(diǎn)，RLP-C檢測(cè)方法的探索經(jīng)歷了漫長(zhǎng)而艱辛的過程。但至今，國(guó)內(nèi)外仍沒有定量檢測(cè)RLP-C的參考方法，各實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果沒有可比性，更無法投入臨床使用。本研究中使用的酶法檢測(cè)血清RLP-C，其檢測(cè)系統(tǒng)性能和臨床評(píng)價(jià)已在其他研究［21］中驗(yàn)證過。

鑒于目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究采用Friedewald方程估算值評(píng)估殘余膽固醇，本研究分析了996例研究對(duì)象RLP-Cm與RLP-Ce的相互關(guān)系。Bland-Altman法和ICC法均表明RLP-C酶法測(cè)定值與估算值一致性欠佳，在臨床上替代使用可能并不合適。進(jìn)一步分析顯示，RLP-Ce較RLP-Cm平均偏高0.2 mmol/L（95%CI：0.18～0.23 mmol/L）。這與Varbo等［12］研究的結(jié)果相差不大（計(jì)算值比測(cè)量值平均偏高0.4 mmol/L）。此外，本研究分析了所有脂蛋白膽固醇的相互關(guān)系：RLP-Cm與HDL-C之間呈負(fù)相關(guān)（rs＝-0.2，P＜0.001），與LDL-C、TC、non-HDL-C、RLP-Ce和TG均存在正相關(guān)關(guān)系，rs分別為0.13、0.25、0.3、0.4和0.53（P＜0.001）。其中，RLP-Ce、RLP-Cm與TG之間的相關(guān)性最高（rs分別為0.64和0.53，P＜0.001）。深入研究結(jié)果顯示，隨著TG濃度逐漸升高，HDL-C呈下降趨勢(shì)，LDL-C水平變化不大，RLP-Ce和RLP-Cm均隨之遞增。在TG分別為＜1、1～1.99、2～2.99、3～3.99、4～4.99及＞5 mmol/L時(shí)，RLP-Cm/RLP-Ce比值卻逐漸減小，分別為81%、62%、51%、54%、46%和45%。而在丹麥哥本哈根城市人口的研究［20］中，當(dāng)TG＜1 mmol/L和≥5 mmol/L時(shí)，RLP-Cm/RLP-Ce比值僅為9%和43%。與本研究相差較大，不排除系人群種族差異和定量檢測(cè)方法不同所造成。同時(shí)，這也暗示了TG升高導(dǎo)致As發(fā)生可能是通過RLP-C濃度的增加實(shí)現(xiàn)的。

本研究是國(guó)內(nèi)為數(shù)不多的采用全自動(dòng)生化分析儀定量檢測(cè)血清RLP-C的研究，其檢測(cè)性能和臨床性能均在其他研究［21］中得到驗(yàn)證，定量測(cè)量法有更好的臨床實(shí)用性。此外，本研究也呼吁，RLP-C估算法并不能完美替代定量檢測(cè)法，我們急需制定RLP-C的標(biāo)準(zhǔn)定義和測(cè)量參考方法。同時(shí)，為了減緩我國(guó)AsCVD近年劇增的嚴(yán)峻形勢(shì)，未來AsCVD一級(jí)預(yù)防和二級(jí)預(yù)防或許應(yīng)該給予RLP-C足夠重視。