同時測定血漿血管緊張素Ⅰ、Ⅱ和醛固酮的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的建立與評價

于蕾，胡濱，吳潔，李倩倩，陳寶榮（.北京金域醫(yī)學檢驗實驗室有限公司實驗診斷部，北京 000；.北京化工大學化學學院，北京 0009；.沃特世科技（北京）有限公司，北京 0076）

繼發(fā)性高血壓的精準診斷是高血壓診療的難點。2020年王夢琳等［1］報道我國高血壓?？苹颊咧欣^發(fā)性高血壓占39.26%。原發(fā)性醛固酮增多癥（primary aldosteronism，PA）是最常見的繼發(fā)性高血壓疾病之一［2-3］。《原發(fā)性醛固酮增多癥診斷治療的專家共識（2020版）》推薦ARR為PA篩查的首選指標［2］。ARR包括醛固酮（aldosterone，Aldo）與血漿腎素活性的比值和醛固酮與血漿腎素濃度的比值兩種形式。放射免疫分析法（RIA）測定的是腎素活性，即單位時間內(nèi)血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ的水平，間接反映血漿中腎素活性水平。化學發(fā)光法測定的是腎素濃度。根據(jù)RAAS血壓調(diào)控機制和既往研究，血管緊張素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ）、血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）和Aldo是PA等繼發(fā)性高血壓篩查和鑒別診斷的主要實驗室依據(jù)［4］。

既往AngⅠ和Aldo的檢測方法包括RIA、化學發(fā)光法（CLIA）、高效液相色譜法等［4-6］，而AngⅡ的檢測方法主要是RIA［6］。由于免疫學方法測定上述激素存在非特異性干擾，van der Gugten等［7］建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）測定AngⅠ的方法，Meunier等［8］建立了LC-MS/MS測定血漿Aldo的方法。受技術(shù)發(fā)展的限制，直至2021年，Chen等［9］采用LC-MS/MS建立了同時檢測腎素活性、AngⅡ和Aldo的方法。鑒于AngⅠ、AngⅡ和Aldo對PA鑒別診斷的重要價值，本實驗室在充分研究AngⅠ、AngⅡ和Aldo分子結(jié)構(gòu)與測量特性的基礎上，建立了一種新的可同時檢測上述3種重要血漿成分的LC-MS/MS方法，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 超高效液相色譜串聯(lián)Xevo TQ-S質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；AcquityTMpremier HSS T3色譜柱（100×2.1 mm，1.8μm，美國Waters公司）；96孔固相萃取SPE板（Oasis MAXμElution SPE，美國Waters公司）；Eppendorf手動移液器（德國Eppendorf公司）。

標準品為AngⅠ（純度＞99%，批號20202120-4，上海譜芬公司）、AngⅡ（純度＞99%，批號2020421-4，上海譜芬公司）、Aldo（純度＞99.1%，批號FN05141904，美國Cerilliant公司）；內(nèi)標品為AngⅠ-［13C6，15N］（純度≥95%，批號1756675，美國Anaspec公司）、AngⅡ-［13C6，15N］（純度≥95%，批號1955630，美國Anaspec公司）、Aldo-［2H7］（純度≥98%，批號PG1-2019-216A1，美國Isosciences公司）。甲醇、乙腈、甲酸、異丙醇均為HPLC級，購自德國Merck公司；氨水（優(yōu)級純，國藥集團化學試劑公司）、水為一次蒸餾水；牛血清清蛋白（BSA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、大豆胰蛋白酶抑制劑（SBTI）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）均購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 BSA緩沖液和溫育液配制

1.2.1 BSA緩沖液配制 精密稱量0.1 g BSA加入10 mL 0.01 mol/L的PBS緩沖液中，配制成濃度為10 mg/mL的BSA緩沖液。

1.2.2 溫育液配制 稱取7.40 g EDTA、12.11 g Tris-base、0.063 g PMSF和0.01 mg SBTI，加入90 mL蒸餾水溶解，用乙酸調(diào)節(jié)pH為5.4～5.5。

1.3 標準曲線和內(nèi)標液配制

1.3.1 標準曲線配制

1.3.1.1 單一標準品儲備液配制 用十萬分之一精密電子天平分別稱取AngⅠ、AngⅡ和Aldo標準品各0.02 mg，移液器準確加入1 mL 20%乙腈溶解，配制濃度均為20μg/mL的單一標準品儲備液。

1.3.1.2 混合標準品儲備液配制 移取不同體積的單一標準品儲備液，20%乙腈稀釋得到AngⅠ、AngⅡ、Aldo濃度為10、0.1、1μg/mL的混合標準品儲備液。

1.3.1.3 S1～S10標準曲線配制 用BSA緩沖液將混合標準品儲備液倍比稀釋至10個濃度，AngⅠ濃度為0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、50、100 ng/mL；AngⅡ為0、0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.500、1.000 ng/mL；Aldo為0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 ng/mL。

1.3.2 內(nèi)標液配制

1.3.2.1 單一內(nèi)標儲備液配制 稱取AngⅠ-［13C6，15N］、AngⅡ-［13C6，15N］和AngⅡ-［13C6，15N］各0.01 mg，移液器取1 mL 20%乙腈溶解，配制濃度均為10μg/mL的單內(nèi)標儲備液。

1.3.2.2 混合內(nèi)標儲備液配制 移取不同體積的單內(nèi)標儲備液，20%乙腈稀釋得到3種化合物對應內(nèi)標濃度為50、20、500 ng/mL的混合內(nèi)標儲備液。1.3.2.3 內(nèi)標工作液配制 用20%乙腈稀釋混合內(nèi)標儲備液至AngⅠ-［13C6，15N］、AngⅡ-［13C6，15N］、Aldo-［13C6，15N］濃度為0.5、0.2、5 ng/mL的內(nèi)標工作液。

1.4 樣本前處理

1.4.1 預處理樣本 分別取200μL待測樣本，加入200μL溫育液，在37℃溫育3 h后加300μL內(nèi)標工作液，得到預處理樣本。

1.4.2 固相萃取 在96孔正壓裝置上，用200μL含1%甲酸的50%乙腈水溶液活化SPE板。取550 μL預處理樣本至SPE板上，然后加200μL含1%氨水的10%甲醇洗滌雜質(zhì)。接著將SPE板下方的廢液板更換為96孔樣品板，用40μL含1%甲酸的50%乙腈水溶液洗脫待測物并收集至樣品板待測。

1.5 LC-MS/MS分析

1.5.1 色譜條件 色譜柱：AcquityTMpremier HSS T3；柱溫：40℃；進樣量：15μL；運行時間：5 min；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速0.4 mL/min的液相梯度見表1。

表1 流動相梯度

1.5.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜分析采用電噴霧離子源（ESI）；監(jiān)測模式：多反應監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓：1.00 kV；離子源溫度：50℃；去溶劑氣溫度：550℃；去溶劑氣流速：1 100 L/h。AngⅠ、AngⅡ和Aldo的定量監(jiān)測離子對質(zhì)荷比（m/z）分別為：433.1＞619.4、349.8＞136.1、359.2＞331.1，對應內(nèi)標品定量離子對（m/z）分別為：435.4＞625.5、352.1＞136.2、367.3＞339.2；碰撞電壓：30 V。

1.6 方法學性能評價 根據(jù)《液相色譜-質(zhì)譜臨床應用建議》［10］對建立的方法進行性能評價。

1.6.1 線性 取10個濃度點的標準曲線S1～S10，按1.4樣本前處理后，重復檢測3次。使用多元回歸方程評價線性，記錄線性方程和相關系數(shù)（r）。各濃度點實測值與理論值偏差＜15%，CV＜15%且r＞0.998，可用于樣本定量。

1.6.2 檢出限（LOD）和定量限（LOQ） LOD是指方法在規(guī)定的實驗條件下所能檢出分析物的最低濃度，而LOQ是方法能準確檢測的最低濃度。選擇AngⅠ、AngⅡ和Aldo濃度分別為0.1、0.001、0.01 ng/mL，0.2、0.002、0.02 ng/mL，0.5、0.005、0.05 ng/mL的3個低濃度水平樣本進行測定，每個濃度水平的樣本重復檢測10次。信噪比＞3的最低濃度為本法的LOD。若同時滿足信噪比＞10且連續(xù)進樣CV＜15%的最低濃度為本法的LOQ。

1.6.3 回收率 在正常人低值血漿中分別添加不同濃度的AngⅠ、AngⅡ和Aldo標準品，制備3個不同濃度水平的待測樣本。其中，AngⅠ的濃度分別為5.0、20.0、50.0 ng/mL；AngⅡ的濃度分別為0.020、0.080、0.200 ng/mL；Aldo的濃度分別為0.10、0.40、1.00 ng/mL。在同一天內(nèi)完成3個濃度樣本、每個濃度樣本重復6次的檢測，并同時測定空白血漿濃度。每個樣本按實測濃度/理論濃度×100%計算回收率。

1.6.4 實驗室間比對 采用本法檢測2021年國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心室間質(zhì)評樣本202112、202114、202115的AngⅠ、AngⅡ和Aldo濃度。根據(jù)給定的質(zhì)譜法靶值（多家實驗室測定結(jié)果的穩(wěn)健均值）判斷本室測量結(jié)果的準確性。

1.6.5 精密度 根據(jù)《液相色譜-質(zhì)譜臨床應用建議》［10］，測定低、中、高3個濃度水平樣本進行精密度評估。每個濃度水平樣本每天測量5次，連續(xù)測3天，計算同一批次內(nèi)5個樣本（批內(nèi)）和3個批次（批間）的變異系數(shù)CV。建議CV應＜15%。

1.6.6 基質(zhì)效應 選取5人血漿和溶劑基質(zhì)，前處理后分別添加低、高濃度標準品。其中，溶劑基質(zhì)為20%乙腈，添加的AngⅠ、AngⅡ、Aldo低濃度標準品為5.0、0.050、0.50 ng/mL，高濃度為50.0、0.500、5.00 ng/mL。此外，向上述樣本中均加入相同體積的內(nèi)標工作液。經(jīng)內(nèi)標校正后，若血漿基質(zhì)與溶劑基質(zhì)的信號比值在85%～115%范圍，可認為無明顯基質(zhì)效應。

1.6.7 攜帶污染 即評估高值樣本對低值樣本的影響。其中，高值樣本AngⅠ、AngⅡ和Aldo濃度分別為：50.0、0.500、5.00 ng/mL，低值樣本為：0.2、0.002、0.020 ng/mL。首先低值樣本連續(xù)進樣5次，然后高、低樣本交替進樣5次。計算連續(xù)進樣和交替進樣的低值樣本的差值，應小于連續(xù)進樣的3倍標準差（SD）。

1.6.8 凍融次數(shù) 樣本多次凍融可能會影響實驗結(jié)果，因此進行樣本的反復凍融實驗。選取4例臨床樣本，分別進行凍融1、2、3次實驗，查看樣本反復凍融對結(jié)果的影響。

1.6.9 參考區(qū)間驗證 隨機選擇25名無血壓增高的健康志愿者，男性11名，女性14名，年齡23～43歲。采集清晨空腹靜脈血到EDTA-K2抗凝管中，并立即離心（25℃，10 min，離心力1 000×g），采用LC-MS/MS法檢測各血漿樣本中AngⅠ、AngⅡ和Aldo濃度。

2 結(jié)果

2.1 AngⅠ、AngⅡ和Aldo的代表色譜圖 血漿中AngⅠ、AngⅡ和Aldo的色譜圖見圖1，該方法分析時間為5 min。AngⅠ、AngⅡ和Aldo能有效分離，峰型對稱，保留時間分別為1.93、1.83和3.33 min。

圖1 AngⅠ、AngⅡ和Aldo色譜圖

2.2 線性 將AngⅠ、AngⅡ及Aldo的10個濃度標準曲線點S1～S10采用本法檢測，AngⅠ、AngⅡ和Aldo濃度范圍分別為0.2～50.0 ng/mL、0.002～0.500 ng/mL、0.02～5.00 ng/mL時，各濃度點實測值與理論值偏差均＜10%且CV＜15%。AngⅠ、AngⅡ和Aldo的擬合線性方程為：y＝0.803x+0.021、y＝0.003x-0.001和y＝0.003x（r＝0.999，P＜0.001），線性評價通過。

2.3 LOD和LOQ 樣本中AngⅠ、AngⅡ和Aldo濃度為0.1、0.001、0.01 ng/mL時，信噪比均＞3，該濃度為本法的LOD。而樣本中AngⅠ、AngⅡ和Aldo濃度為0.2、0.002、0.02 ng/mL時，連續(xù)進樣10次，信噪比均＞20且同時滿足連續(xù)進樣CV為1.8%～9.8%，該濃度為本法的LOQ。

2.4 回收率 采用本法測定血基質(zhì)空白、低、中、高濃度樣本，去除空白樣本濃度后，AngⅠ、AngⅡ、Aldo的加標回收率分別為91%～95%、98%～103%、91%～93%。加標回收率均在85%～115%之間，結(jié)果見表2。

表2 AngⅠ、AngⅡ和Aldo的加標回收率

2.5 實驗室間比對 采用本方法測定國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心2021年室間質(zhì)評3個樣本202112、202114、202115，本方法AngⅠ、AngⅡ和Aldo檢測值與靶值偏差為-9.7%～7.2%，檢測結(jié)果全部在國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心給定的等效范圍內(nèi)（見表3）。

表3 實驗室間比對結(jié)果

2.6 精密度 對低、中、高3個不同濃度的樣本連續(xù)檢測3 d、每天檢測5個平行樣本，結(jié)果見表4。AngⅠ、AngⅡ和Aldo的批內(nèi)CV分別為1.4%～3.6%、2.2%～5.1%、2.4%～3.3%；批間CV分別為1.5%～4.6%、2.1%～4.4%、3.0%～5.2%，本法精密度良好。

表4 AngⅠ、AngⅡ和Aldo的精密度

2.7 基質(zhì)效應 通過內(nèi)標校正后，5名研究對象血漿基質(zhì)與溶劑基質(zhì)的信號比值分別為85%～100%（AngⅠ）、90%～109%（AngⅡ）、106%～114%（Aldo），均在85%～115%范圍。表明加入內(nèi)標品后，可有效補償基質(zhì)增強或抑制，該方法無明顯基質(zhì)效應。

2.8 攜帶污染 AngⅠ低值樣本連續(xù)進樣和高、低值樣本交替進樣峰面積差值為173.2，小于連續(xù)進樣的3SD（227.6）。因此，當AngⅠ樣本濃度低于50 ng/mL時，攜帶污染可忽略。而AngⅡ和Aldo無攜帶污染。

2.9 樣本凍融次數(shù) 進行樣本反復凍融實驗，以4例臨床樣本AngⅠ、AngⅡ和Aldo的濃度平均值隨凍融次數(shù)的變化，評估反復凍融對檢測結(jié)果的影響。對于AngⅠ和Aldo，樣本凍融2次和3次，濃度變化均在1.5%以內(nèi)，無明顯差異。而AngⅡ，樣本凍融2次變化較??；樣本凍融3次，結(jié)果明顯降低29.5%。因此，建議樣本凍融次數(shù)不超過2次。

2.10 參考區(qū)間驗證 對臨床表觀正常、無RAAS相關基礎疾病的25名健康志愿者樣本采用該方法進行檢測，所有人均為坐位采血。檢測結(jié)果如下：成人血漿中AngⅠ、AngⅡ、Aldo的濃度范圍分別為1.4～11.8 ng/mL、0.003～0.016 ng/mL、0.02～0.20 ng/mL。腎素活性0.47～3.95 ng·mL-1·h-1，與徐雯等［11］建立的參考區(qū)間（0.25～5.12 ng·mL-1·h-1）一致。AngⅡ濃度與美國實驗室Mayo Clinic參考區(qū)間0.005～0.040 ng/mL對應［12］。Aldo濃度也與Meunier等［8］測定范圍（0.02～0.23 ng/mL）相符。

3 討論

采用不同的測量原理、不同方法學測量RAAS的3個激素時，由于使用非同源測量方法常導致臨床測量結(jié)果合理分析、正確使用難度大。因此，血漿AngⅠ、AngⅡ和Aldo同時檢測一直是臨床實驗室的期望。受測量技術(shù)、儀器性能等的影響，既往一個方法一般僅能檢測其中一項。首先，AngⅠ、AngⅡ和Aldo化學性質(zhì)差異較大，AngⅠ和AngⅡ為生物大分子且電離后為多電荷正離子，而Aldo為小分子且電離后為負離子，要將3種物質(zhì)完全分離并達到檢測質(zhì)量要求，對檢測儀器性能要求很高；其次，AngⅡ在血漿中含量極低，約5～40 pg/mL，檢測困難；此外，AngⅠ和AngⅡ均為分子量1 000以上的多肽類物質(zhì)，極易與常規(guī)使用的C8色譜柱等發(fā)生吸附作用，因此在檢測前需耗費大量的時間平衡色譜柱。本研究通過優(yōu)選色譜柱、色譜條件和離子對篩選目標化合物，并采用正負離子切換模式進行檢測，在有效分離3種化合物的同時實現(xiàn)樣本中AngⅡ檢測濃度低至2 pg/mL的準確測量。

與中山醫(yī)院2021年建立的同時測定腎素活性、AngⅡ和Aldo的方法［9］比較，本研究采用TQ-S質(zhì)譜儀，通過優(yōu)化測量條件以及選用專為AngⅠ、AngⅡ等多肽大分子設計的AcquityTMpremier新型色譜柱，靈敏度顯著提高。在血漿使用量僅200μL條件下，AngⅠ的LOQ 0.2 ng/mL（比較方法0.33 ng/mL）、AngⅡ的LOQ 0.002 ng/mL（比較方法0.015 ng/mL），能更好地滿足臨床檢測需求。

RIA曾經(jīng)作為腎素活性檢測的“金標準”，可檢測腎素的范圍是0.2～6.0 ng·mL-1·h-1［13］。而本研究AngⅠ的線性范圍為0.2～50.0 ng/mL，本方法可檢測的腎素活性范圍為0.07～16.7 ng·mL-1·h-1。對于AngⅡ和Aldo，CLIA可檢測的線性范圍均為0.01～1.00 ng/mL，而LC-MS/MS分別為0.002～0.500 ng/mL和0.02～5.00 ng/mL。對比可知，本研究建立的LC-MS/MS新方法不僅實現(xiàn)了AngⅠ、AngⅡ和Aldo的同時準確測量，也較傳統(tǒng)方法的檢測范圍更寬、靈敏度更高。

本方法通過超高效液相分離技術(shù)有效分離待測物，通過同位素內(nèi)標品和標準品進行校正，保證檢測結(jié)果的準確性，方法加標回收率在89%～102%之間。檢測國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心實驗室間質(zhì)量評價樣本，其結(jié)果表明本法與其他同類實驗室測量結(jié)果一致性好。另外，采用本法測量了25名健康成人血漿中AngⅠ、AngⅡ、Aldo濃度，結(jié)果與文獻［8，11-12］報道一致。鑒于本法測量原理可靠，其在測量性能方面已展現(xiàn)出的良好性能，未來是否能助力PA的實驗室診斷的標準化，還有待進一步研究證實。