一測多評法測定黑果腺肋花楸果中三種花色苷的含量①

張婷婷，李蘭蘭，李新霞

(新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊830011)

黑果腺肋花楸果(Black chokeberry)又稱不老莓，是薔薇科腺肋花楸屬植物黑果腺肋花楸[Aronia melanocarpa(Michx.)Elliott]的果實，2018年9月國家衛(wèi)健委正式批準黑果腺肋花楸果為新型食品原料[1]。黑果腺肋花楸果實中主要化學成分為花青素、黃酮、多酚[2-3]等，花青素是黑果腺肋花楸果中最主要的多酚類物質(zhì)，在植物體內(nèi)多以糖苷形式存在，稱為花色苷，主要由矢車菊素-3-O-半乳糖苷（Cyanidin-3-OGalactoside,C3Ga）、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷(Cyanidin 3-O-arabinoside,C3A)、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside,C3G)和矢車菊素-3-O-木糖苷組成[4]。近年來大量的研究表明黑果腺肋花楸果花色苷提取物具有較強的抗氧化[5-6]、抗衰老[7]、抗癌[8]、降血糖血脂[9-10]等活性。目前多采用pH 示差法[11-12]、高效液相色譜外標法[13-14]測定花色苷含量。pH示差法雖然價格便宜但只適用于檢測總花色苷含量，且易受輔色素轉(zhuǎn)化等因素影響，引起誤差；高效液相色譜外標法同時對多個花色苷成分進行測定時價格昂貴成本較高。一測多評法(Quantitative analysis of multi-components by single-marker, QAMS)是可用于多成分質(zhì)量控制，通過只測定某個(易得、價格較低、有效)代表性成分，同時計算出其它待測有效成分的含量的方法[15-17]，該方法操作簡單,成本較低。本研究在建立外標法的基礎(chǔ)上，采用一測多評法以價格相對較低的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為內(nèi)參，建立另外兩種成分的校正因子并計算含量，為黑果腺肋花楸果質(zhì)量評價提供一種低成本的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC-2030C 高效液相色譜儀及色譜工作站(日本島津公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀及色譜工作站(美國安捷倫科技公司)；150 W,40 kHZ 超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；AB135-S 分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；Exceed-EUV 純水儀(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；AQ-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Gensial-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Agilent-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。

1.2 試藥C3Ga(北京索萊寶科技有限公司，批號：220G021)、C3G(北京索萊寶科技有限公司，批號：1217N021)、C3A(北京索萊寶科技有限公司，批號：311F021)、色譜乙腈(美國Merck)、鹽酸、甲醇、甲酸為分析純。

1.3 藥材黑果腺肋花楸果粉由新疆埃樂欣藥業(yè)有限公 司 提 供(批 號：S1:20210103、S2:20210118、S3:20210223、S4:20210318、S5:20210425、S6:20210508)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取C3Ga、C3G、C3A對照品各適量，用甲醇(含2%HCl，V/V)配制成濃度分別為90.00、9.80、60.00μg/mL的花色苷混合對照品母液，經(jīng)稀釋配制成C3Ga、C3G、C3A 系列濃度分別為7.00、11.66、19.44、32.40、54.00、90.00 μg/mL；0.76、1.27、2.12、3.53、5.88、9.80 μg/mL；4.67、7.78、12.96、21.60、36.00、60.00μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取黑果腺肋花楸果粉1.0 g，用80%含酸甲醇(0.8% HCL 調(diào)節(jié)pH 至2～3)，料液比1∶10，40 ℃條件下超聲提取40 min，冷卻至室溫后濾過，取濾液1 mL定容至10 mL即得。

2.2 色譜條件色譜柱：AQ-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流動相：乙腈(A)-0.5%甲酸(B)，梯度洗脫(0～15 min, 10%A～14%A; 15～20 min, 14%A～16%A; 20～30 min, 16%A～19%A; 30～35 min, 19%A; 35～40 min,19%A～10%A)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：520 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20μL，見圖1。

圖1 混合對照品(A)和黑果腺肋花楸果供試品(B)色譜圖

2.3 外標法方法學考察

2.3.1 回歸方程的建立 分別吸取“2.1.1”項下C3Ga、C3G、C3A 系列濃度混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣，以濃度為X軸，峰面積為Y軸，得到C3Ga、C3G、C3A 的線性回歸方程，結(jié)果C3Ga 的回歸方 程 為Y= 59454X- 3212.5，r=0.9998，濃 度 在7.00～90.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；C3G的回歸方 程 為Y= 73673X- 164.77，r=0.9998，濃 度 在0.76～9.80 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；C3A 的回歸方程為Y= 76238X- 3621.2，r=0.9998，濃度在4.67～60.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 日內(nèi)間精密度 分別精密吸取C3Ga、C3G、C3A的低、中、高濃度混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣，重復進樣3 次，連續(xù)3 d，記錄C3Ga、C3G、C3A的峰面積，計算日內(nèi)間精密度，見表1。

表1 日內(nèi)間精密度

2.3.3 重復性試驗 按“2.1.2”項下操作，提取同一批黑果腺肋花楸果粉供試品溶液(n=6)，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄C3Ga、C3G、C3A 色譜峰面積，計算得到C3Ga、C3G、C3A 峰面積的RSD分別為0.60%、1.26%、0.96%，表明方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 吸取“2.1.2”項下供試品溶液于0、2、4、6、8、12和24 h依法進樣，按“2.2”項下方法測定，分別記錄C3Ga、C3G、C3A 峰面積并計算RSD，RSD分別為0.70%、0.92%、0.87%，表明C3Ga、C3G、C3A 溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗 分別吸取供試品溶液適量，以0.8∶1、1：1、1.2：1 加入C3Ga、C3G、C3A 對照品溶液，依法測定，經(jīng)計算C3Ga、C3G、C3A 對照品的加樣回收率分別為1.92%、1.70%、1.01%，見表2。

表2 回收率試驗

2.4 相對校正因子的建立精密吸取“2.1.1”項下系列濃度混合對照品溶液各適量，按“2.2”項下方法測定，以C3G 為內(nèi)參，按公式：f=AS×Ci/Ai×Cs式中：Ci 為C3G 濃度，Ai 為C3G 峰面積，Cs 為待測組分濃度，As為待測組分峰面積計算C3Ga、C3A 的相對校正因子，見表3。

表3 相對校正因子結(jié)果

2.5 校正因子耐用性考察

2.5.1 不同檢測波長的影響 精密吸取“2.1.1”項下濃度分別為54.00、5.88、36.00 μg/mL 的C3Ga、C3G 和C3A 混合對照品溶液(n=3)，按“2.2”項下方法測定，記錄不同波長(518、520、522 nm)下的峰面積，以C3G 色譜峰為內(nèi)參，計算相對校正因子。C3Ga、C3A 相對校正因子均值分別為1.2671、1.0465，RSD分別為0.024%、0.16%。表明當檢測波長在518～522 nm范圍內(nèi)波動時，校正因子不受影響。

2.5.2 不同柱溫對校正因子的影響 精密吸取“2.1.1”項下濃度分別為54.00、5.88、36.00 μg/mL 的C3Ga、C3G 和C3A 混合對照品溶液(n=3)，按“2.2”項下方法測定，記錄不同柱溫(25、30、35 ℃)下的峰面積，以C3G 色譜峰為內(nèi)參，計算相對校正因子。C3Ga、C3A相對校正因子均值分別為1.2545、1.0664，RSD分別為1.01%、1.85%。表明當柱溫在25～35 ℃范圍內(nèi)波動時，對校正因子的測定影響不大。

2.5.3 不同流速對校正因子的影響 精密吸取“2.1.1”項下濃度分別為54.00、5.88、36.00 μg/mL 的C3Ga、C3G 和C3A 混合對照品溶液(n=3)，按“2.2”項下方法測定，記錄不同流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)下的峰面積，以C3G 色譜峰為內(nèi)參，計算相對校正因子。C3Ga、C3A相對校正因子均值分別為1.2443、1.0687，RSD分別為1.58%、1.86%。表明流速在0.8～1.2 mL/min對校正因子無顯著影響。

2.5.4 儀器與色譜柱的考察 精密吸取“2.1.1”項下濃度分別為54.00、5.88、36.00 μg/mL 的C3Ga、C3G 和C3A 混合對照品溶液(n=3)，按“2.2”項下方法測定，分別采用島津LC-2030C，Agilent 1260 高效液相色譜儀，Agilent XDB-C18、AQ-C18、Gensial-C18色譜柱依法測定，記錄C3Ga、C3G、C3A 峰面積，以C3G 色譜峰為內(nèi)參，計算相對校正因子。C3Ga、C3A 相對校正因子分別為1.2576、1.0714，RSD分別為1.02%、2.72%。表明相對校正因子受儀器與色譜柱影響不顯著，見表4。

表4 不同儀器與色譜柱對校正因子的影響

2.6 待測色譜峰的定位精密吸取“2.1.1”項下濃度分別為54.00、5.88、36 .00 μg/mL 的5 號C3Ga、C3G 和C3A 混合對照品溶液(n=3)，按“2.2”項下方法測定，考察不同儀器與色譜柱對C3Ga、C3A 相對保留時間的影響。結(jié)果表明各成分相對保留時間受儀器與色譜柱影響較小，見表5。

表5 不同儀器與色譜柱對保留時間的影響

2.7 樣品含量測定取不同批次黑果腺肋花楸果粉，按“2.1.2”項下制備供試品溶液(n=3)，按“2.2”項下方法測定，記錄各批次供試品中C3Ga、C3G、C3A 色譜峰面積，分別采用外標法和QAMS法計算不同批次黑果腺肋花楸果粉中花色苷含量，外標法測定6批黑果腺肋花楸果中C3G 含量分別為0.139、0.148、0.131、0.204、0.088、0.159 mg/g；C3Ga 分別為3.899、4.184、3.698、5.855、2.334、4.537 mg/g；C3A 分 別 為1.070、1.142、1.009、1.597、0.641、1.239 mg/g；QAMS 法測定6批黑果腺肋花楸果中C3Ga 分別為3.898、4.196、3.714、5.879、2.344、4.561 mg/g；C3A 分 別 為1.068、1.143、1.012、1.602、0.641、1.244 mg/g。Pearson相關(guān)性分析表明兩種方法所測數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)為1.000，P值為0.000，測定結(jié)果具有顯著相關(guān)性，說明建立的一測多評方法結(jié)果準確，見表6。

表6 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

前期實驗對花色苷類成分進行前處理考察，發(fā)現(xiàn)花色苷類成分在酸性甲醇中提取效率更高，因此后續(xù)以80%甲醇（0.8%HCl，V/V），超聲40 min，料液比1∶10，提取1次為最佳前處理條件。本實驗采用梯度洗脫建立黑果腺肋花楸果3種花色苷類成分HPLC法，本方法與文獻[14]相比化合物分離度較好，3種成分方法學驗證均符合要求。在此基礎(chǔ)上以最為常見且價格較低的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品為內(nèi)參，建立一測多評法測定黑果腺肋花楸果中3 種花色苷類成分含量。經(jīng)典外標法雖可對3 種花色苷進行測定，但由于使用多種花色苷類對照品成本較高，而一測多評法可用一種花色苷對照品利用相對校正因子對多種花色苷成分進行定量，并根據(jù)相對保留時間進行定性，實現(xiàn)以一種成分同時對多種成分進行定性定量的目的?；ㄉ疹惓煞肿畲笪詹ㄩL在500～550 nm 之間，在此波長范圍內(nèi)干擾較小，在520 nm 最大吸收波長進行檢測時，矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷成分響應更高，峰面積更大，可用于定量分析。另外還發(fā)現(xiàn)另一花色苷類成分，經(jīng)文獻查閱后，認為可能是矢車菊素-3-O-木糖苷，后續(xù)可采用液質(zhì)聯(lián)用進一步指認。

一測多評法由王智民等[18]于2006年首次提出，目前多用于解決對照品稀有、昂貴，缺乏對照品或多指標評價中藥質(zhì)量等方案，2020 版《中國藥典》采用一測多評法收載品種有黃連、穿心蓮、銀杏葉片[19]等藥材及制劑，該方法也被美國藥典等所采納。黑果腺肋花楸果中富含多種花色苷，但花色苷類成分不穩(wěn)定且價格較高，不易獲得，采用一測多評法可實現(xiàn)多種花色苷類成分的同步測定，低成本為黑果腺肋花楸果中花色苷質(zhì)量評價提供新方法。