LSEC、Raw264.7、Hepa1-6三種鼠源細胞系cGAS-STING信號通路的本底表達及激活研究①

周鈺婷,張 勇,楊 建,李 飛

（1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011，2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院廣西肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，3桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院廣西神經(jīng)鞘脂代謝相關(guān)疾病基礎(chǔ)研究重點實驗室，廣西 桂林 541001）

cGAS-STING 信號通路是一個可以識別細胞內(nèi)異常DNA 的天然免疫信號通路[1]。此信號通路在機體對抗病原微生物感染及抗腫瘤免疫反應(yīng)中起到了重要作用，同時該信號通路的異常激活也可導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生[2]。研究表明，cGASSTING 信號通路普遍表達于肝臟等各組織細胞，且在固有免疫細胞中呈高表達[3]。肝臟分為肝實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞，肝實質(zhì)細胞的比例約為60%～80%，其余20%～40%為肝臟非實質(zhì)細胞包括肝竇內(nèi)皮細胞（Liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)、巨噬細胞（又稱庫普弗細胞，Kupffer Cell，KCs）、樹突狀細胞、星狀細胞等[4]。LSECs是肝臟內(nèi)數(shù)目最多的肝臟非實質(zhì)細胞，約占肝臟非實質(zhì)細胞總數(shù)的50%[5]。肝巨噬細胞對于維持肝臟本身以及整個身體的體內(nèi)平衡具有不可或缺的作用[6]。本研究采用LSEC、Raw264.7、Hepa1-63 種細胞分別模擬肝竇內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、肝實質(zhì)細胞，探討經(jīng)典cGAS-STING 激活劑poly(dA:dT)、DMXAA 以及乙型肝炎病毒對3 種細胞cGAS-STING信號通路相關(guān)基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞小鼠肝竇內(nèi)皮細胞（LSEC）、小鼠肝癌細胞系（Hepa1-6）、人肝癌細胞（HepG2.2.15）均由廣西肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室贈送并保存，小鼠巨噬細胞（Raw264.7）購自中科院細胞庫。

1.2 試藥胎牛血清（美國Gibco 公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）;0.25%胰酶、青鏈霉素（中國Solarbio 公司）；Lipofectamine3000（中國Invitrogen公司）；EZ-press RNA Purification Kit（美國EZBioscience 公司，批號：B0004D）、2×SYBR Green qPCR Master Mix (ROX2 plus)（美國EZBioscience 公司，批號：A0001-R2）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國諾唯贊公司）；RIPA細胞/組織蛋白裂解液（中國碧云天公司）；兔源二抗、鼠源二抗（美國Thermo 公司）；重組Anti-IRF3 抗體（美國Abcam 公司，批號：ab68481）；cGAS Rabbit pAb，p-IRF3 抗體（中國ABclonal 公司）；TMEM173/STING Polyclonal Antibody（中國Proteintech 公司，批號：19851-1-AP）；β-Actin 抗體(C4):sc-47778（美國Santa Cruz 公司）;磷酸化IRF3 抗體（中國生工生物工程公司）；小鼠STING 激活劑2,5-己酮可可堿（DMXAA）（中國阿拉丁公司）；poly(dA:dT)（中國Invivogen公司）；聚乙二醇8000（中國阿拉丁公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)LSEC、Raw264.7、Hepa1-6、人肝癌細胞（HepG2.2.15）細胞用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，前3 種細胞每2～3 天更換培養(yǎng)基，待貼壁生長良好后使用0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。HepG2.2.15 細胞每2 天收集上清液，細胞經(jīng)PBS洗滌后繼續(xù)培養(yǎng)，收集的上清液進行后續(xù)實驗。

1.3.2 本底蛋白質(zhì)的提取與檢測 取處于對數(shù)生長期的LSEC、Raw264.7、Hepa1-6 細胞，經(jīng)消化離心后取相同細胞數(shù)（1×105個/管）至1.5 mL EP 管中提取蛋白，提取方法如下：每管細胞中加入100 μL 的RIPA裂解液，充分裂解后冰上放置20 min；4℃，12000 r/min，離心15 min；吸取上清至另一1.5 mL EP 管；加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，充分混勻后100℃加熱5 min，室溫冷卻后置于-20℃冰箱儲存待用。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot），進行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、顯影。分別加入一抗cGAS（1∶500）、STING（1∶1000）、p-IRF3（1∶500）、IRF3（1∶1000），內(nèi)參選擇β-Actin（1∶4000），二抗為HRP 標記的山羊抗兔、鼠（1∶10000），采用ECL 發(fā)光顯影，經(jīng)Image J 軟件進行蛋白灰度值測定。

1.3.3 Poly(dA:dT)刺激的影響 取處于對數(shù)生長期的LSEC、Raw264.7、Hepa1-6 細 胞，經(jīng) 消 化 離 心 后，LSEC、Raw264.7、Hepa1-6 細胞分別按4×105、6×105、6×105個/孔接種于6 孔板，每種細胞分為，藥物刺激組、未刺激組（每組3 孔）。培養(yǎng)過夜后，藥物刺激組使用Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑將PRR 激動劑poly(dA:dT)（0.4 μg/mL）轉(zhuǎn)染至細胞中，未刺激組加入等量的DMEM 培養(yǎng)基，12 h 后收集細胞，采用EZB 快速RNA 提取試劑盒提取RNA，經(jīng)諾唯贊逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)EZB 2×SYBR Green qPCR Master Mix 在Bio-Rad PCR 儀中進行實時熒光定量PCR（Q-PCR）擴增，引物序列如下：cGAS：5'- CAGGAAGGAACCGGACAAGC-3'（F），5'-CCGACTCCCGTTTCTGCATT-3'（R）；STING：5'-TCGCACGAACTTGGACTACTG-3'（F），5'-CCA ACTGAGGTATATGTCAGCAG-3'（R）；IFN-β：5'- GGATCCTCCACGCTGCGTTCC-3'（F），5'-CCGCCCTGTAGGTGAGGTTGA-3'（R）；β-actin：5'-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3'（F），5'-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3'（R）。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火/延伸30 s，共40 個循環(huán)，以β-actin 為內(nèi)參，依據(jù)目的基因相對表達量RQ=2-△△Ct算法分析基因mRNA相對表達量。

1.3.4 DMXAA 刺激的影響 細胞培養(yǎng)、接種及分組同上，過夜培養(yǎng)后藥物刺激組將小鼠STING蛋白激活劑DMXAA（20 μg/mL）直接加入培養(yǎng)基中，未刺激組加入等量的DMSO，12 h 后收集細胞提取蛋白和RNA，采用Western blot 和Q-PCR 實驗方法對相關(guān)基因進行檢測，提取檢測過程同上。

1.3.5 HBV 感染的影響 將收集過濾的HepG2.2.15 細胞上清液每34 mL 加入6 mL 40%聚乙二醇8000 進行濃縮，上下顛倒混勻后4℃過夜；4℃，10000 r/min離心1 h，棄去上清后，用含10%胎牛血清的PBS重懸沉淀，4℃搖床過夜；4℃，3000 r/min離心10 min，吸取上清至另一1.5 mL EP 管放至-80℃冰箱待用。細胞培養(yǎng)、接種及分組同上，過夜培養(yǎng)后HBV 感染組將濃縮后的HBV（MOI=10）加入到培養(yǎng)基中感染細胞，未感染組加入等量的PBS，12 h 后收集細胞提取蛋白和RNA，采用Western blot 和Q-PCR 實驗方法對相關(guān)基因進行檢測，提取檢測過程同上。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用GraphPad Prism8 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LSEC、Raw264.7、Hepa1-63 種細胞中cGASSTING 信號通路關(guān)鍵基因的本底表達情況比較3種細胞的本底表達量，LSEC 細胞cGAS、STING 的蛋白本底表達量最高，見圖1。

圖1 LSEC、Raw264.7、Hepa1-6細胞cGAS、STING的蛋白表達情況

2.2 Poly(dA:dT)對3種細胞的cGAS-STING信號通路的影響與未刺激組相比，poly(dA:dT)刺激顯著提高LSEC、Hepa1-6 細胞cGAS、STING，IFN-β mRNA的水平（P＜0.05）；顯著提高Raw264.7 細胞IFN-β mRNA 的水平（P＜0.01）；對Raw264.7細胞中的cGAS、STING的表達量無影響，見表1。

表1 poly(dA:dT)對3種細胞在cGAS-STING信號通路中mRNA表達量影響的比較（±s，n=3）

表1 poly(dA:dT)對3種細胞在cGAS-STING信號通路中mRNA表達量影響的比較（±s，n=3）

注：與未刺激組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

細胞LSEC Raw264.7 Hepa1-6組別未刺激組poly(dA:dT)刺激組未刺激組poly(dA:dT)刺激組未刺激組poly(dA:dT)刺激組cGAS 1.05±0.112.51±0.22**0.89±0.080.80±0.060.53±0.121.99±0.07**STING 0.93±0.091.35±0.18*0.90±0.030.83±0.140.70±0.180.91±0.01*IFN-β 0.99±0.0365.75±4.26**0.94±0.0746.76±4.77**0.88±0.1238.51±4.48**

2.3 DMXAA 對3 種細胞cGAS-STING 信號通路的影響與未刺激組相比，DMXAA 可顯著提高LSEC、Raw264.7、Hepa1-6 細胞cGAS、STING mRNA 的表達（P＜0.05）；可顯著提高Raw264.7、Hepa1-6 細胞IFNβ mRNA的表達（P＜0.01）；對LSEC細胞IFN-β mRNA的表達無影響，見表2。Western Blot 結(jié)果顯示，與未刺激組相比，DMXAA 可顯著提高LSEC、Hepa1-6 細胞cGAS 的蛋白表達水平（P＜0.01）；顯著降低三種細胞STING 蛋白的表達水平（P＜0.01），但顯著提高STING 的磷酸化水平（P＜0.01）；顯著提高p-IRF3 的蛋白表達水平（P＜0.01），見圖2、表3。

表2 DMXAA對3種細胞在cGAS-STING信號通路中mRNA表達量影響的比較（±s，n=3）

表2 DMXAA對3種細胞在cGAS-STING信號通路中mRNA表達量影響的比較（±s，n=3）

注：與未刺激組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

細胞LSEC Raw264.7 Hepa1-6組別未刺激組DMXAA刺激組未刺激組DMXAA刺激組未刺激組DMXAA刺激組cGAS 1.14±0.312.15±0.08**0.99±0.011.21±0.07*0.99±0.085.61±0.43**STING 0.96±0.202.04±0.33**0.92±0.071.23±0.05*0.94±0.091.97±0.05**IFN-β 1.09±0.181.04±0.020.92±0.0916.41±2.78**0.89±0.1416.97±2.67**

圖2 DMXAA對3種細胞在cGAS-STING信號通路中蛋白水平上的影響

表3 DMXAA對3種細胞在cGAS-STING信號通路中蛋白表達量影響的比較（±s，n=3）

表3 DMXAA對3種細胞在cGAS-STING信號通路中蛋白表達量影響的比較（±s，n=3）

注：與未刺激組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

細胞LSEC Raw264.7 Hepa1-6組別未刺激組DMXAA刺激組未刺激組DMXAA刺激組未刺激組DMXAA刺激組cGAS 0.26±0.010.56±0.01**0.81±0.010.78±0.030.61±0.020.73±0.02**STING 2.34±0.040.87±0.02**1.30±0.021.11±0.05**1.13±0.040.45±0.01**p-STING/STING 0.00±0.001.28±0.12**0.00±0.000.87±0.07**0.00±0.000.94±0.01**IRF31.26±0.022.17±0.07**0.61±0.020.60±0.040.14±0.010.34±0.01**p-IRF3/IRF30.00±0.000.14±0.02**0.00±0.000.33±0.01**0.00±0.001.33±0.01**

2.4 HBV感染對3種細胞cGAS-STING 信號通路的影響與未感染組相比，Q-PCR 結(jié)果顯示，HBV 感染對Raw264.7、Hepa1-6 細胞cGAS、STING mRNA 的表達無明顯差異；對LSEC 細胞的cGAS、IFN-β mRNA明顯激活作用（P＜0.05）；明顯抑制Raw264.7、Hepa1-6 細胞的IFN-β mRNA 表達（P＜0.01），見表4。與未感染組相比，Western Blot結(jié)果顯示，HBV處理可顯著促進3 種細胞IRF3 蛋白及磷酸化水平（P＜0.01）；對LSEC 細胞的STING 蛋白水平顯著提高（P＜0.01），顯著降低Raw264.7、Hepa1-6細胞的STING蛋白水平（P＜0.05）；對LSEC 細胞的cGAS 蛋白無影響，明顯抑制Raw264.7 細胞cGAS 蛋白的表達（P＜0.05），明顯促進Hepa1-6 細 胞cGAS 蛋 白 的 表 達（P＜0.01），見 圖3、表5。

表4 HBV感染對3種細胞在cGAS-STING信號通路中mRNA表達量影響的比較（±s，n=3）

表4 HBV感染對3種細胞在cGAS-STING信號通路中mRNA表達量影響的比較（±s，n=3）

注：與未感染組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

細胞LSEC Raw264.7 Hepa1-6組別未感染組HBV感染組未感染組HBV感染組未感染組HBV感染組cGAS 0.92±0.061.23±0.08*1.00±0.070.97±0.181.09±0.131.06±0.07 STING 1.00±0.061.03±0.141.00±0.060.89±0.101.09±0.091.02±0.09 IFN-β 0.95±0.091.33±0.04**1.03±0.090.61±0.09**0.99±0.010.71±0.01**

圖3 HBV感染對3種細胞在cGAS-STING信號通路中蛋白水平上的影響

表5 HBV感染對3種細胞在cGAS-STING信號通路中蛋白表達量影響的比較（±s，n=3）

表5 HBV感染對3種細胞在cGAS-STING信號通路中蛋白表達量影響的比較（±s，n=3）

注：與未感染組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

細胞LSEC Raw264.7 Hepa1-6組別未感染組HBV感染組未感染組HBV感染組未感染組HBV感染組cGAS 0.68±0.010.62±0.010.55±0.010.39±0.02**0.73±0.030.99±0.02**STING 0.83±0.021.21±0.01**0.64±0.010.52±0.03*1.40±0.050.51±0.01**IRF31.31±0.031.45±0.02*0.17±0.010.34±0.02**0.80±0.031.32±0.03**p-IRF3/IRF30.00±0.000.20±0.01**0.01±0.010.27±0.01**0.01±0.010.38±0.01**

3 討論

cGAS-STING 信號通路是病毒病原體檢測和免疫宿主防御機制之間的重要橋梁[7]。Poly(dA:dT)是一種人工合成的雙鏈DNA模擬物，可激活cGAS、AIM2、RIGI 等多種模式識別受體[8]。DMXAA 是一種小鼠STING 蛋白激活劑[9]，它可直接與STING 蛋白結(jié)合從而激活cGAS-STING 下游信號，導(dǎo)致干擾素的產(chǎn)生[10]。本研究證明兩種激活劑均可激活3 種細胞cGAS-STING信號通路，但激活程度存在差異。

HBV 是屬于嗜肝DNA 病毒科的一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，主要感染人類的肝臟[11-12]。Cheng 等[13]發(fā)現(xiàn)HBV可激活巨噬細胞cGAS-STING 信號通路，但有研究認為HBV 對巨噬細胞cGAS-STING 通路有一定抑制作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV 對代表肝實質(zhì)細胞的Hepa1-6細胞無激活作用，對Raw264.7細胞中IFN-β 的表達有顯著的抑制作用，而對LSEC 細胞中cGASSTING 信號通路相關(guān)關(guān)鍵基因的表達均有促進作用。由于cGAS-STING 信號通路的激活會產(chǎn)生干擾素[15]，從而抑制HBV 的復(fù)制，LSEC 細胞中這種促進作用的發(fā)現(xiàn)為HBV 的治療提供了新的靶點。鑒于cGASSTING 信號通路異?？蓪?dǎo)致肝癌、慢性乙肝感染等多種肝臟疾病的發(fā)生[16]，本研究的發(fā)現(xiàn)對于闡明這些疾病的發(fā)病機制也具有重要意義。

由于人源LSEC 細胞株不易獲得且公認的人源巨噬細胞系相當缺乏，因而本研究選用了3種鼠源細胞作為實驗細胞，這不可避免地限制了本研究的臨床意義。后續(xù)的研究可使用人的原代細胞闡明人類肝實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞中cGAS-STING 的表達及激活情況。此外，本研究僅探討了3種細胞的本底及激活劑激活后cGAS-STING 信號通路的響應(yīng)情況，后續(xù)研究可使用siRNA 技術(shù)等手段阻斷關(guān)鍵基因以進一步探討各個基因在cGAS-STING 通路激活中的角色。