GNB2L1在宮頸癌中的表達(dá)及與患者預(yù)后的相關(guān)性分析①

馬澤坤，李金秋，買迪努爾·買買提，素比努爾·吾布力卡斯木，祁光偉，鄭博源，阿仙姑·哈斯木，林 晨

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011）

宮頸癌是目前女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的主要原因之一，宮頸癌侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致疾病進(jìn)展、治療失敗的重要因素[1]。宮頸癌晚期患者5年平均生存率為8%～12%，而早期或癌前疾病中被確診的患者5年平均生存率為90%[2]。宮頸癌早期診斷和及時(shí)治療可確?；颊叩牧己妙A(yù)后，延長(zhǎng)生存期[3]。宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌發(fā)生的主要原因是高危型人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）持續(xù)性感染[4]。因此，研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，探尋與宮頸癌診斷治療及預(yù)后相關(guān)的分子基因靶點(diǎn)至關(guān)重要。

鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β 多肽2 樣蛋白1（GNB2L1）是由7 個(gè)色氨酸-天冬氨酸（WD-40）重復(fù)序列構(gòu)成的β 片層結(jié)構(gòu)域，能與多種蛋白質(zhì)相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，直接參與重要基因的表達(dá)調(diào)控，影響細(xì)胞增殖、凋亡及遷移[5-7]。有研究表明，GNB2L1 在多種惡性腫瘤中高表達(dá)并與其不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為影響細(xì)胞分化和代謝紊亂的新因素[8-10]。本研究探討GNB2L1 在宮頸癌中的表達(dá)水平及作用，以期為宮頸癌患者的預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織樣本收集2010年6月—2013年3月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科收治的132 例宮頸鱗癌（CSCC）患者、56 例宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）患者宮頸組織，32 例無(wú)宮頸疾病患者正常宮頸（NC）組織。所有患者均進(jìn)行婦科檢查，按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)完成分期，并收集患者臨床病理資料。所有患者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)，己過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20180223-128）。

1.2 試劑與儀器SP 試劑盒、DAB 顯色試劑（中杉金橋）；GNB2L1 siRNA（上海，吉?jiǎng)P）；RIPA 組織細(xì)胞裂解液（北京，索萊寶）；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（上海，Thermo Scientific）；兔抗人GNB2L1 多克隆抗體(美國(guó)，Abcam) 、兔抗人GAPDH多克隆抗體(武漢，ProteinTeach)、Quanti Nova SYBR Green PCR Kit 試劑盒與QIAamp DNA Mini Kit 試劑盒(德國(guó)，QIAGEN)；胎牛血清、DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)，Gibco）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Hoechst（上海，碧云天）；BODIPY（美國(guó)，Invitrogen）；實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀與熒光定量PCR儀(美國(guó)，Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)測(cè)定 將宮頸組織用4% 中性甲醛固定，石蠟包埋，烘烤、脫蠟、水化、抗原修復(fù)，加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶抑制劑，室溫下放置30 min。加入一抗，4°C孵育過(guò)夜；次日加入二抗，37℃孵育30 min，PBS 洗滌3 次，DAB試劑顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)梯度酒精脫水，干燥，樹(shù)膠封片。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察，由2位病理科高級(jí)職稱醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行綜合評(píng)分，按照腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度和分布進(jìn)行半定量分析。得分9～12分為高表達(dá)，5～8分為中度表達(dá)，1～4分為低表達(dá)。

1.3.2 總RNA 的提取及qRT-PCR 技術(shù) 液氮中取出CSCC、CIN 及NC 宮頸組織，置于研缽中磨碎，利用TRIzol 等試劑提取組織中總RNA。采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作內(nèi)參，利用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒檢測(cè)GNB2L1 基因的表達(dá)情況。GNB2L1 引物設(shè)計(jì)如下：GNB2L1-F：5'-TGAGTGTGCCTTCT-3'；GNB2L1-R：5'-GCTTGCAGCTTAGCCAGGTTC-3'；GAPDH-F：5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3'；GAPDH-R：5'-GT AGCCAGGCCGTGA-3'。反應(yīng)結(jié)束后，保存溶解曲線、擴(kuò)增曲線及對(duì)應(yīng)Ct 值(達(dá)到閾值循環(huán)數(shù))。采用RQ=2-△△CT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 Western blot 測(cè)定 待細(xì)胞數(shù)量生長(zhǎng)至≥1×106個(gè)時(shí)，經(jīng)消化離心，取細(xì)胞沉淀，加入100μL RIPA 細(xì)胞裂解液，1μL PMSF，冰上裂解30 min，4℃，12000 r／min，離心15 min，收集上清；BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總蛋白濃度；經(jīng)蛋白定量及高溫變性后，取出少量蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離90 min，90 V 穩(wěn)壓下經(jīng)2 h電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入封閉液，室溫封閉30 min，4℃加入一抗孵育過(guò)夜（GNB2L1 抗體稀釋比為1∶600；GAPDH 抗體稀釋比為1∶5000），加入二抗孵育（1∶1000）2 h 后，采用ECL 法顯色，使用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行拍照、蛋白灰度值掃描，與內(nèi)參β-actin 進(jìn)行比較，計(jì)算出GNB2L1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 基因組DNA 提取與DNA 拷貝數(shù)分析QIAamp DNA Mini Kit 試劑盒提取宮頸組織樣本基因組DNA，并進(jìn)行濃度測(cè)定，質(zhì)檢合格基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)如下：GNB2L1-F:5'-GCAGCAACCCTATCATCGTC-3'；GNB2L1-R:5’-CGGTAGCCATTTCTCATTCA-3'，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶；切割產(chǎn)物亮帶，將回收的PCR產(chǎn)物重組至pEASY-T1載體，將PCR陽(yáng)性克隆樣本送至烏魯木齊歐易生物公司測(cè)序，確定陽(yáng)性克隆，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；采用qRT-PCR 檢測(cè)樣品Ct值數(shù)據(jù)，計(jì)算GNB2L1基因拷貝數(shù)。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒感染 將人子宮頸癌C33a、SiHa 細(xì)胞及人宮頸上皮細(xì)胞(H8)置于含10%胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素和鏈霉素）完全培養(yǎng)基的DMEM（高糖）培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞數(shù)量達(dá)到80%～90%時(shí)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染所取的siRNA 的靶序列為：shGNB2L1-2:5'-GCAAGATCATTGTAGATGA-3'。以正常生長(zhǎng)細(xì)胞為正常對(duì)照組，以空載慢病毒轉(zhuǎn)染shNON 的細(xì)胞為陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染shGNB2L1 慢病毒的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 利用生物信息學(xué)、STRING、TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，確定CSCC 中差異表達(dá)的基因相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)通路。根據(jù)文獻(xiàn)[8]中蛋白組學(xué)和微陣列研究結(jié)果，選擇表達(dá)一致的基因作為實(shí)驗(yàn)差異基因。將差異基因輸入至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，確定蛋白質(zhì)亞基間的潛在關(guān)系，構(gòu)建相互作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

1.3.7 BODIPY 染色 在6孔板中等量鋪入C33a 和Si-Ha 細(xì)胞，每孔加入含10 %胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液2 mL。待細(xì)胞貼壁，加入油酸儲(chǔ)存液，24 h 后去除培養(yǎng)液，PBS 洗滌1次，5 min/次；4%多聚甲醛固定15 min，去除4 %多聚甲醛，PBS 洗滌3 次，3 min/次。每孔中加入BODIPY 熒光染料0.1 μg/mL，避光，37 ℃孵育，孵育20 min，PBS 洗滌3 次，5 min/次。每孔中加入濃度為1 μg/mL 的赫斯特染色劑，避光，37 ℃孵育15 min，PBS 洗滌3 次，5 min/次，在熒光顯微鏡下采集圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.8 生存分析 電話隨訪收集患者術(shù)后生存信息，以患者死亡為終點(diǎn)事件，隨訪時(shí)間截至2020年12月31日。Kaplan-Meier分 析 和logrank試 驗(yàn) 分 析GNB2L1 蛋白的表達(dá)水平與患者總體生存期間的相關(guān)性，患者中位總生存期（OS）是指最初診斷為CSCC至死亡或最終隨訪的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0、Graphpad prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)分析GNB2L1 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。t檢驗(yàn)分析GNB2L1 在不同組織中的拷貝數(shù)。利用Image J 軟件對(duì)BODIPY 染色平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GNB2L1 表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CIN 組織（n=16 例）和NC組織（n=16 例）比較，CSCC 組織（n=16 例）中GNB2L1的mRNA 相對(duì)表達(dá)量較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1A）；Western blot 結(jié)果顯示，GNB2L1蛋白在正常宮頸組織、CIN1、CIN2、CIN3、宮頸鱗癌I 期、II期、III 期組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.253±0.005）、（0.516±0.002）、（0.789±0.007）、（0.926±0.005）、（1.152±0.003）、（1.274±0.005）、（1.400±0.015），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1B、1C）。免疫組化結(jié)果顯示，GNB2L1在NC、CIN 和CSCC 組織中表達(dá)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)（圖2）。CSCC 組織中GNB2L1 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率90.15%（119/132）顯著高于CIN 組織66.07%（37/56）、正常宮頸組織43.75%（14/32）的陽(yáng)性表達(dá)率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；GNB2L1 高表達(dá)與臨床分期(P=0.017)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.049)、細(xì)胞分化程度(P=0.001)相關(guān)（表1）。

圖1 GNB2L1 mRNA與GNB2L1蛋白的表達(dá)情況

圖2 免疫組化檢測(cè)GNB2L1蛋白在宮頸病變組織中的表達(dá)

表1 GNB2L1蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

2.2 GNB2L1 表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的相關(guān)性GNB2L1高表達(dá)患者的總生存期（43.13±1.65）個(gè)月顯著低于GNB2L1 低表達(dá)患者的總生存期（63.39±2.28）個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。

2.3 GNB2L1 基因拷貝數(shù)結(jié)果CSCC 組織中的GNB2L1 的DNA 拷貝數(shù)（297200±10815）copies/ng 顯著高于NC 組織(215100±7276）copies/ng，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。

2.4 GNB2L1 在正常宮頸細(xì)胞及宮頸鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)Western blot 結(jié)果顯示，GNB2L1 蛋白在SiHa、C33a、H8細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.208±0.074）、（1.564±0.663）、（0.641±0.032），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖3A）。qRT-PCR結(jié)果表明，SiHa、C33a細(xì)胞中GNB2L1 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為(1.388±0.370)、(2.231±0.376)明顯高于H8(1.000±0.000)細(xì)胞的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖3B）。

圖3 H8、SiHa、C33a中GNB2L1蛋白與mRNA的表達(dá)

2.5 GNB2L1信號(hào)通路調(diào)控與基因相互作用網(wǎng)絡(luò)通過(guò)基因富集分析檢測(cè)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE9750 和GSE68339，發(fā)現(xiàn)宮頸癌中GNB2L1 表達(dá)與侵襲轉(zhuǎn)移特征存在相關(guān)性，將差異基因輸入至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，脂肪酸代謝相關(guān)的信號(hào)通路Akt/mTOR 和Jak-STAT參與GNB2L1的表達(dá)（圖4A）。

2.6 BODIPY 染色結(jié)果實(shí)驗(yàn)組C33a 細(xì)胞和SiHa 細(xì)胞BODIPY 染色平均熒光強(qiáng)度低于陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組細(xì)胞，脂質(zhì)的生成水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），（表2、圖4B）。

圖4 差異蛋白的網(wǎng)絡(luò)分析及脂質(zhì)合成情況

表2 各組細(xì)胞BODIPY 染色平均熒光強(qiáng)度比較/（±s，AU）

表2 各組細(xì)胞BODIPY 染色平均熒光強(qiáng)度比較/（±s，AU）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01；與陰性對(duì)照組比較，△P＜0.01。

組別正常對(duì)照組陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組BODIPY 染色平均熒光強(qiáng)度C33a 64.750±6.24660.923±3.36236.532±2.884*△SiHa 70.106±1.05366.575±10.60735.857±7.392*△

3 討論

GNB2L1 作為一種支架蛋白，在異常表達(dá)腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子通路中發(fā)揮著重要作用[11]。研究顯示，GNB2L1 在口腔鱗癌[12]、肝細(xì)胞癌[13]和胰腺導(dǎo)管腺癌[14]等多種癌癥中高表達(dá)。在乳腺癌中，GNB2L1 可引起AKT 信號(hào)通路活化，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖[15-16]。在惡性黑色素瘤細(xì)胞中，GNB2L1 可通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。GNB2L1 也可作為預(yù)測(cè)口腔鱗癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物[18]。有研究表明，GNB2L1 過(guò)表達(dá)可影響p53 信號(hào)通路，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[19-20]。本研究結(jié)果顯示，與CIN 和NC 組織相比，CSCC 組織中GNB2L1的表達(dá)顯著增高。較高的GNB2L1表達(dá)水平與宮頸癌FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和細(xì)胞分化程度有關(guān)。說(shuō)明GNB2L1 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。GNB2L1高表達(dá)宮頸癌患者與GNB2L1低表達(dá)宮頸癌患者比較，其總生存期較短。提示過(guò)表達(dá)的GNB2L1可能與宮頸癌不良預(yù)后有關(guān)。基因拷貝數(shù)結(jié)果顯示，CSCC 組織中GNB2L1的DNA 拷貝數(shù)顯著高于NC組織，可能與宮頸組織中GNB2L1 蛋白差異表達(dá)有關(guān)。與H8 細(xì) 胞 比 較，C33a、SiHa 細(xì) 胞 中GNB2L1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯升高。 說(shuō)明GNB2L1過(guò)表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

雖然GNB2L1 與CSCC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但宮頸癌受復(fù)雜的多基因和多分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的調(diào)控，并且伴隨各種腫瘤基因的協(xié)同作用，共同促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展。研究指出，GNB2L1 可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路上調(diào)cyclin D1 表達(dá)影響宮頸癌的淋巴轉(zhuǎn)移能力，也可通過(guò)影響RhoA 激酶促進(jìn)宮頸癌SiHa 細(xì)胞的侵襲能力[21-23]。本研究利用生物信息學(xué)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的交互網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，GNB2L1 與脂肪酸代謝相關(guān)的信號(hào)通路Akt/mTOR 和Jak-STAT 相互作用。提示上述信號(hào)通路可作為進(jìn)一步深入研究的候選途徑。GNB2L1 可與不同的信號(hào)蛋白結(jié)合，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[24-25]。文獻(xiàn)報(bào)道，GNB2L1在脂質(zhì)代謝中有調(diào)節(jié)PI3K表達(dá)和AKT磷酸化的作用[26]，推測(cè)GNB2L1 通過(guò)AKT/mTOR 信號(hào)通路調(diào)節(jié)脂肪酸代謝。本研究BODIPY 染色結(jié)果表明，GNB2L1能夠增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積，提示GNB2L1與脂質(zhì)代謝有關(guān)。

綜上所述，GNB2L1可能參與并促進(jìn)宮頸癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展，這有望為宮頸癌的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供一個(gè)新的分子靶點(diǎn)。