基于小RNA深度測(cè)序技術(shù)鑒定侵染我國(guó)部分省市草莓種苗的病毒種類

王佳 白瑩雪 祝寧 齊長(zhǎng)紅 任俊達(dá) 韓成貴 尚巧霞

摘要 隨著草莓保護(hù)地栽培面積的增加和無(wú)性繁殖種苗的繁殖與調(diào)運(yùn)，草莓病毒病的發(fā)生與流行日益嚴(yán)重。為明確侵染我國(guó)部分省市草莓種苗的病毒種類，應(yīng)用小RNA深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并利用RT-PCR技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證及序列分析。結(jié)果表明，從來(lái)自我國(guó)7省市的41株具有典型病毒病癥狀的草莓種苗樣品中檢測(cè)到草莓斑駁病毒strawberry mottle virus （SMoV）、草莓鑲脈病毒strawberry vein banding virus（SVBV）和草莓輕型黃邊病毒strawberry mild yellow edge virus （SMYEV）3種。SMoV、SVBV和SMYEV的檢出率分別為34.1%、24.4%和2.4%。選取不同產(chǎn)地草莓種苗上檢出的不同病毒進(jìn)行部分序列測(cè)定和分析，獲得了3個(gè)SMoV分離物（四川分離物schhy13、遼寧分離物lnhy23和河北分離物hbhy28）的部分RNA1 3′端非編碼區(qū)606 bp核苷酸序列，其一致性為98.12%～99.34%。測(cè)定并獲得了5個(gè)SVBV分離物（遼寧分離物lnhy15、lnhy17、lnhy24、河北分離物hbhy28和陜西分離物shaxhy35）的ORF6的部分基因及其5′端非編碼區(qū)的核苷酸序列，其中部分ORF6基因序列的一致性為97.98%～99.8%。僅1個(gè)遼寧樣品中檢測(cè)到SMYEV，獲得了遼寧分離物lnhy26，其CP基因序列與中國(guó)甘肅分離物sy02的一致性為99.02%。病毒侵染草莓植株產(chǎn)生的典型癥狀有葉片畸形、變色和植株矮化。存在2種病毒和3種病毒復(fù)合侵染的情況，占所有陽(yáng)性樣品的41.2%。遼寧和河北的‘紅顏種苗中檢出SMoV和SVBV或SMoV、SVBV和SMYEV的復(fù)合侵染情況;四川和陜西的‘紅顏種苗僅檢出SMoV或SVBV，而其他省市和品種均未檢出病毒。研究結(jié)果可以為草莓病毒的檢測(cè)以及草莓病毒病的科學(xué)防治提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 草莓病毒病;小RNA深度測(cè)序技術(shù);RT-PCR;病毒檢測(cè)

中圖分類號(hào)： S436.639

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021079

Abstract With the increase of protected cultivation area， propagation and transportation of strawberry asexual reproductive seedlings between different regions are increasingly frequent， and the occurrence and prevalence of strawberry viral disease are also becoming more and more serious. To identify the viruses infecting strawberry plants from different provinces of China， small RNA deep sequencing assay was used to detect the viruses in strawberry seedling samples， and then the detected viruses were further verified by RT-PCR and sequence analysis. The results showed that strawberry mottle virus （SMoV）， strawberry vein banding virus （SVBV） and strawberry mild yellow edge virus （SMYEV） were detected in 41 strawberry seedlings with typical symptoms from seven provinces of China. The positive rates of SMoV， SVBV and SMYEV detection were 34.1%， 24.4% and 2.4%， respectively. Strawberry seedling samples infected by different viruses from different regions were selected， from which the partial viral nucleotide sequences of the detected viruses were sequenced and analyzed. The partial 3′ UTR nucleotide sequences of RNA1 of three samples infected by SMoV from Sichuan， Liaoning and Hebei were sequenced， which was 606 bp in length. The partial SMoV nucleotide sequences among Sichuan isolate schhy13， Liaoning isolate lnhy23 and Hebei isolate hbhy28 shared identity from 98.12% to 99.34%. The sequences of partial ORF6 gene and its 5′ UTR of SVBV Liaoning isolates lnhy15， lnhy17， lnhy24， Hebei isolate hbhy28 and Shaanxi isolate shaxhy35 were obtained. The partial ORF6 gene nucleotide sequences of five SVBV samples shared identity from 97.98% to 99.8%. Only one sample with SMYEV was detected from Liaoning， and the CP gene sequence of Liaoning isolate lnhy26 shared identity of 99.02% with that of Gansu isolate sy02. Symptoms of strawberry plants infected by virus included leaf deformity， leaf discoloration and dwarf. The detection results showed that combined infection by two or three viruses existed， and the detection rate accounted for 41.2% of virus-positive samples. ‘Benihoppe seedlings from Liaoning and Hebei were simultaneously infected by SMoV and SVBV or SMoV， SVBV and SMYEV. ‘Benihoppe seedlings from Sichuan and Shaanxi were only infected by SMoV or SVBV， but no virus was detected in strawberry seedlings sampled from other provinces or in other varieties. This study provided important information and techniques for virus detection and strawberry viral disease management.1617EC4E-91A2-4AC0-96D3-3A8AA5458DFA

Key words strawberry viral disease;small RNA deep sequencing technology;RT-PCR;virus detection

草莓因具有種植周期短、投資少、經(jīng)濟(jì)收益高等優(yōu)點(diǎn)成為重要的經(jīng)濟(jì)作物，在全球范圍內(nèi)廣泛種植[1]。我國(guó)的草莓產(chǎn)業(yè)經(jīng)過(guò)近40年的迅猛發(fā)展，生產(chǎn)面積和產(chǎn)量已躍居世界首位[2]。

在我國(guó)，草莓以冬春保護(hù)地栽培和依賴匍匐莖無(wú)性繁殖種苗為主，高溫高濕的生長(zhǎng)環(huán)境和無(wú)性繁殖的種植方式導(dǎo)致草莓斑駁病毒strawberry mottle virus （SMoV）、草莓鑲脈病毒strawberry vein banding virus （SVBV）、草莓輕型黃邊病毒strawberry mild yellow edge virus （SMYEV）和草莓皺縮病毒strawberry crinkle virus（SCV）引起的病毒病發(fā)生日益嚴(yán)重，同時(shí)伴有這些病毒的新株系和病毒種類產(chǎn)生，嚴(yán)重影響草莓的品質(zhì)和產(chǎn)量，對(duì)草莓產(chǎn)業(yè)構(gòu)成威脅[1，3-5]。2008年楊洪一等[6]從起源自我國(guó)甘肅的‘五葉草莓和自育的‘長(zhǎng)虹2號(hào)中分離到1個(gè)SMYEV的新株系類型。2014年Chen等[7]首次報(bào)道黃瓜花葉病毒cucumber mosaic virus （CMV）對(duì)我國(guó)的草莓產(chǎn)業(yè)構(gòu)成威脅，2017年Ding等[8]首次發(fā)現(xiàn)福建的草莓感染草莓白化病毒strawberry pallidosis-associated virus （SPaV）。

小RNA深度測(cè)序技術(shù)相對(duì)于ELISA和RT-PCR等檢測(cè)方法，其結(jié)果更全面，也更易發(fā)現(xiàn)未知的病毒[9]。我國(guó)學(xué)者已利用該技術(shù)從福建和湖南等地的草莓上發(fā)現(xiàn)了一些新的病毒種類[8，10]。因此，筆者采用小RNA深度測(cè)序技術(shù)對(duì)來(lái)自北京、河北、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、四川和云南的草莓種苗進(jìn)行檢測(cè)，并利用RT-PCR對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)分析，以明確我國(guó)不同省市草莓種苗病毒病的發(fā)生情況和病毒種類，為進(jìn)一步繁育草莓脫毒種苗和病毒病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年11月27日，從北京市昌平區(qū)南邵鎮(zhèn)草莓種植園采集41株具有明顯畸形、矮化、斑駁和皺縮等典型病毒病癥狀的草莓種苗葉片樣品，種苗的來(lái)源和品種包括產(chǎn)自北京的‘白雪公主（1株）和‘隋珠（4株），河北的‘光點(diǎn)（2株）、‘紅顏（4株）和‘圣誕紅（2株），遼寧的‘紅顏（10株），內(nèi)蒙古的‘紅顏（2株），陜西的‘紅顏（2株），四川的‘紅顏（10株）和云南的‘圣誕紅（4株）。

1.2 主要試劑

EASYspin植物RNA快速提取試劑盒、2×Taq PCR Mix購(gòu)自北京愛(ài)博森生物科技有限公司;dNTPs、5×M-MLV逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑購(gòu)自TaKaRa公司;DEPC水購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 具有典型病毒病癥狀的草莓種苗葉片樣品的小RNA深度測(cè)序

文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序及原始數(shù)據(jù)整理：由北京優(yōu)吉科技有限公司完成。提取41株具有典型病毒病癥狀的草莓種苗葉片樣品的總RNA，并使用Agilent 2100和NanoDrop測(cè)定總RNA的濃度、完整性和純度。質(zhì)量合格的RNA樣品采用NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina構(gòu)建小RNA文庫(kù)。先后在3′端和5′端加上接頭，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后用Qubit 2.0和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)文庫(kù)的濃度進(jìn)行定量，并用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的插入片段長(zhǎng)度（insert size）進(jìn)行檢測(cè)。最后，使用Illumina Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)檢測(cè)合格的小RNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。從獲得的序列中篩除低質(zhì)量、長(zhǎng)度小于18 nt或大于40 nt、帶polyA或polyN等條件的小RNA序列，獲得有效數(shù)據(jù)（clean reads）[11]。使用PFOR軟件和Velvet軟件對(duì)clean reads中的序列進(jìn)行拼接得到重疊群（contigs），與NCBI中的病毒數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTn和BLASTx比對(duì)分析并注釋，獲得可能存在的病毒序列信息。

對(duì)獲得的病毒序列信息進(jìn)行整理分析，初步確定感染病毒的草莓葉片樣品，以及可能存在的病毒種類。

1.3.2 RT-PCR驗(yàn)證小RNA深度測(cè)序結(jié)果

1.3.2.1 草莓組織總RNA的提取

參照陳柳等[12]的方法從初步確定感染病毒的草莓葉片樣品中提取總RNA。

1.3.2.2 RT-PCR

上述提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以1.5 μL的總RNA為模板，加入隨機(jī)引物 （9mer）（50 μmol/L）和Oligo（dT）18 Primer（50 μmol/L）各0.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）2 μL，DEPC水將體系補(bǔ)至15.5 μL。65℃水浴5 min，冰浴5 min。向體系中加入5×M-MLV逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（100 U/μL）和RNase抑制劑（40 U/μL）各0.5 μL。42℃ 1 h，70℃ 15 min。合成的cDNA于-20℃保存。

根據(jù)小RNA深度測(cè)序確定的病毒種類，利用病毒的特異性引物（表1）對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系： cDNA模板2 μL，正向和反向引物（10 mmol/L）各1 μL，2×Taq PCR mix 12.5 μL，DEPC水將體系補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序： 94℃預(yù)變性 2 min;94℃變性 30 s，退火40 s（退火溫度見(jiàn)表1），72℃延伸 60 s，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1617EC4E-91A2-4AC0-96D3-3A8AA5458DFA

SMoV[13]、SVBV[14]和SMYEV[15]的特異性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，分別能擴(kuò)增出SMoV RNA1的3′端部分非編碼區(qū)核苷酸序列、SVBV ORF6部分基因及其5′ 端非編碼區(qū)核苷酸序列和SMYEV完整的外殼蛋白（coat protein， CP）基因及該基因兩端部分非編碼區(qū)核苷酸序列。

1.3.3 序列測(cè)定和分析比較

取目的條帶明亮的PCR產(chǎn)物送交北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果在NCBI上與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并利用MEGA 7.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 病毒檢出率計(jì)算

統(tǒng)計(jì)檢測(cè)樣品中各種病毒的陽(yáng)性樣品數(shù)，并計(jì)算病毒檢出率。病毒檢出率=陽(yáng)性樣品數(shù)/總檢測(cè)樣品數(shù)×100%[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小RNA深度測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

對(duì)41株具有典型病毒病癥狀的草莓種苗樣品進(jìn)行小RNA深度測(cè)序，經(jīng)質(zhì)量控制獲得142 945 074條clean reads，其中長(zhǎng)度為21、22 nt和24 nt的小RNA序列最多，分別占clean reads數(shù)量的50.35%、14.17%和12.13%。與NCBI中的病毒數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果顯示，共有488 276條reads來(lái)自病毒，占clean reads數(shù)量的0.34%。

將長(zhǎng)度為18～40 nt的序列拼接后獲得16 202個(gè)contigs，經(jīng)BLASTn比對(duì)分析表明，有261個(gè)contigs與SMoV、SVBV或SMYEV的核苷酸序列的一致性較高，未比對(duì)到其他植物病毒。其中51個(gè)contigs與SMoV核苷酸序列的一致性為92.59%～100%，184個(gè)contigs與SVBV核苷酸序列的一致性為96.67%～100%，26個(gè)contigs與SMYEV核苷酸序列的一致性為84.08%～100%。還有31個(gè)contigs利用BLASTn比對(duì)不到結(jié)果，使用BLASTx比對(duì)后顯示，31個(gè)contigs與SMoV、SVBV或SMYEV的氨基酸序列具有較高的一致性，也未比對(duì)到其他的植物病毒。其中4個(gè)contigs與SMoV氨基酸序列的一致性為95%～100%，1個(gè)contigs與SVBV氨基酸序列的一致性為100%，26個(gè)contigs與SMYEV氨基酸序列的一致性為90%～100%（表2）。

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

利用SMoV、SVBV和SMYEV的特異性引物對(duì)41株草莓種苗樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，并用DNAMAN和MEGA 7.0對(duì)獲得的3種病毒分離物進(jìn)一步分析，以驗(yàn)證小RNA深度測(cè)序結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明，17份樣品中檢測(cè)到這3種病毒，總檢出率為41.5%，SMoV、SVBV和SMYEV的檢出率分別為34.1%、24.4%和2.4%（表3）。

2.2.1 SMoV不同分離物的序列分析

利用SMoV特異性引物SM6126F1/SM6732R1進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，可以擴(kuò)增出約606 bp的目的片段，包含RNA1 3′端非編碼區(qū)部分核苷酸序列。根據(jù)草莓種苗產(chǎn)地不同，選取不同陽(yáng)性樣品進(jìn)行序列測(cè)定，獲得SMoV四川分離物schhy13、遼寧分離物lnhy23和河北分離物hbhy28的序列，GenBank登錄號(hào)分別為MW556623、MW556622和MW556621。利用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)分析，3個(gè)SMoV分離物的核苷酸序列一致性為98.12%～99.34%。與GenBank上已報(bào)道的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，四川分離物schhy13、遼寧分離物lnhy23 和河北分離物hbhy28與加拿大分離物NB926序列（GenBank登錄號(hào)：KU200453.1）的一致性較高，分別為97.68%、99.14%和98.19%;四川分離物schhy13和河北分離物hbhy28親緣關(guān)系較近，與遼寧分離物lnhy23親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，形成兩個(gè)獨(dú)立的小分支（圖1）。

2.2.2 SVBV不同分離物的序列分析

利用SVBV特異性引物SV5508F/SV6606R進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，可以擴(kuò)增出SVBV約1 098 bp的目的片段，包含ORF6部分基因及其5′端非編碼區(qū)的核苷酸序列。根據(jù)草莓種苗產(chǎn)地不同，選取不同地區(qū)草莓種苗陽(yáng)性樣品進(jìn)行序列擴(kuò)增，獲得SVBV遼寧分離物lnhy15、lnhy17、lnhy24、河北分離物hbhy28和陜西分離物shaxhy35，GenBank登錄號(hào)分別為MW556618、MW556617、MW556616、MW556619和MW556615。利用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)分析，5個(gè)SVBV分離物的部分ORF6基因序列一致性為97.98%～99.8%。與GenBank上已報(bào)道的基因序列比對(duì)分析，遼寧分離物lnhy15和lnhy17與北京分離物BJ1（GenBank登錄號(hào)： KT250632.1）的核苷酸序列一致性分別為99.01%和99.42%;遼寧分離物lnhy24和河北分離物hbhy28與北京分離物BJHXTX1（GenBank登錄號(hào)： MF197916.1）的核苷酸序列一致性分別為99.36%和99.44%;陜西分離物shaxhy35與貴州分離物GZ（GenBank登錄號(hào)： MH894295.1）的核苷酸序列一致性為99.52%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果如圖2所示，遼寧分離物lnhy15、lnhy17、lnhy24和河北分離物hbhy28親緣關(guān)系較近，與陜西分離物shaxhy35親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，均與中國(guó)不同省市的分離物有較近的親緣關(guān)系，而與美國(guó)和加拿大分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2.3 SMYEV不同分離物的序列分析

利用SMYEV特異性引物YT1/Y2進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，可以擴(kuò)增出SMYEV約861 bp的目的片段，包含完整的CP基因及該基因兩端部分非編碼區(qū)核苷酸序列[17]。僅獲得1個(gè)遼寧分離物lnhy26的序列（GenBank登錄號(hào)： MW556620），與GenBank的SMYEV CP基因進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，該分離物與中國(guó)甘肅分離物sy02（GenBank登錄號(hào)： EU107084.1）的核苷酸序列一致性為99.02%，且親緣關(guān)系較近（圖3）。1617EC4E-91A2-4AC0-96D3-3A8AA5458DFA

2.3 草莓病毒病典型癥狀

經(jīng)小RNA深度測(cè)序和RT-PCR檢測(cè)不同地區(qū)草莓種苗的病毒侵染情況，結(jié)合表4中的田間癥狀調(diào)查結(jié)果表明，病毒單獨(dú)侵染或2～3種病毒復(fù)合侵染時(shí)，草莓植株可表現(xiàn)出單一癥狀，也可同時(shí)表現(xiàn)出多種癥狀。被同一種病毒單獨(dú)侵染的草莓植株表現(xiàn)出的癥狀也略有不同。主要癥狀如下：

葉片畸形：葉片皺縮;三出復(fù)葉的1～2片小葉生長(zhǎng)較?。▓D4b-d）。

葉片變色：葉片呈不同程度的斑駁、鑲脈或褪綠;葉脈變黑（圖4b-f）。

植株矮化：株高較矮、葉片較小;葉柄細(xì);長(zhǎng)勢(shì)弱（圖4f）。

2.4 不同產(chǎn)地草莓種苗感染病毒的情況

對(duì)北京、河北、內(nèi)蒙古、四川、遼寧、云南和陜西共7個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)）生產(chǎn)的草莓種苗病毒病進(jìn)行調(diào)查和檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。遼寧草莓種苗受病毒危害最為嚴(yán)重，病毒檢出率高達(dá)100.0%，陜西、四川和河北種苗的檢出率分別為50.0%、40.0%和25.0%，而北京、內(nèi)蒙古和云南的草莓種苗未檢測(cè)到病毒。

不同省市的草莓種苗檢出病毒的種類也略有不同。調(diào)查結(jié)果顯示，四川、遼寧和河北的草莓種苗中檢出SMoV，遼寧、河北和陜西的種苗中檢出SVBV，僅遼寧的種苗中檢出SMYEV。病毒復(fù)合侵染發(fā)生較為嚴(yán)重，占總檢出率的41.2%。遼寧和河北的草莓種苗中檢出SMoV和SVBV兩種病毒復(fù)合侵染，僅在1株遼寧草莓種苗中檢出3種病毒復(fù)合侵染。

對(duì)不同省市的‘紅顏‘白雪公主‘隋珠‘光點(diǎn)和‘圣誕紅5個(gè)草莓品種調(diào)查發(fā)現(xiàn)，17個(gè)病毒陽(yáng)性樣品的品種均為‘紅顏，而‘白雪公主 ‘隋珠‘光點(diǎn)和‘圣誕紅均未檢出病毒。

3 討論

小RNA深度測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)提高了植物病毒病病原學(xué)的研究能力，該技術(shù)的原理是將植物被病毒侵染產(chǎn)生的源于病毒的特異小RNA分子序列進(jìn)行拼接，以此來(lái)鑒定病毒種類[18]。此技術(shù)可快速、靈敏、全面檢測(cè)植物體內(nèi)已知和未知病毒的核酸分子，被廣泛用于農(nóng)作物、藥用、園林和園藝植物病毒病的檢測(cè)和鑒定[11，18-22]。但是，它用于單個(gè)樣品的檢測(cè)成本較高，也無(wú)法確定混合樣品中感染病毒的具體樣品，還會(huì)因較短的小RNA分子序列使比對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定程度的誤判。因此，仍需要結(jié)合ELISA和RT-PCR等檢測(cè)方法進(jìn)行使用[23]。

本研究對(duì)來(lái)源于北京、河北、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、四川和云南共7個(gè)省（市、自治區(qū)）的草莓種苗進(jìn)行小RNA深度測(cè)序和生物信息學(xué)分析，并利用病毒特異性引物對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，侵染我國(guó)草莓種苗的病毒主要是SMoV、SVBV和SMYEV，且存在2種病毒和3種病毒復(fù)合侵染的情況。SMoV不同分離物的大外殼蛋白（large coat protein，CPL）基因和依賴RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）基因序列具有較大的差異，而3′非編碼區(qū)的核苷酸序列較保守[24]。因此，測(cè)定了SMoV的RNA1 3′端非編碼區(qū)部分核苷酸序列。經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，本文獲得的SMoV四川分離物schhy13和河北分離物hbhy28與遼寧分離物lnhy23形成了兩個(gè)不同的分支。SVBV中國(guó)不同分離物的核苷酸序列保守性相對(duì)較高，且ORF6編碼的蛋白與寄主范圍和癥狀表現(xiàn)有關(guān)[5，14]。因此，測(cè)定了不同省市SVBV分離物ORF6的部分基因序列。本文獲得的5個(gè)SVBV分離物與GenBank中已登錄的中國(guó)分離物形成一個(gè)獨(dú)立的組群，與美國(guó)和加拿大分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。上述SMoV和SVBV的分組差異可能與地理起源有關(guān)[24]。另外，僅在一個(gè)來(lái)自遼寧的樣品中檢測(cè)到SMYEV，通過(guò)測(cè)定其完整的CP基因及該基因兩端部分非編碼區(qū)核苷酸序列，SMYEV遼寧分離物lnhy26 的CP基因序列可能是與中國(guó)甘肅分離物sy02同屬一個(gè)組群的新株系類型[6]。

被病毒單獨(dú)侵染或2～3種病毒復(fù)合侵染的草莓植株可單獨(dú)或同時(shí)表現(xiàn)出葉片畸形、葉片變色和植株矮化等癥狀，調(diào)查表明田間草莓植株表現(xiàn)出的癥狀與感染病毒的種類關(guān)系不明確。此現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是病毒不同株系侵染后的癥狀略有不同;也可能是RT-PCR無(wú)法檢出含量過(guò)低的病毒，使得檢測(cè)結(jié)果不夠準(zhǔn)確;或是與水肥、藥害、機(jī)械損傷等非病毒因素共同危害產(chǎn)生的[1，25]。在后續(xù)的研究中，可結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)提高檢測(cè)效率，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確[1，26-27]。

不同省市的草莓種苗病毒檢出情況差異顯著，在四川、遼寧、河北和陜西種苗中檢出病毒，而北京、內(nèi)蒙古和云南種苗中未檢出。其中，遼寧種苗的病毒檢出率最高、病毒種類最多，可能與遼寧發(fā)展草莓種植業(yè)的時(shí)間早、規(guī)模大有關(guān)[28]。對(duì)不同品種進(jìn)行病毒檢測(cè)，僅在‘紅顏中檢出病毒，而‘白雪公主 ‘隋珠‘光點(diǎn)和‘圣誕紅均未檢出。可能是‘紅顏?zhàn)鳛橹匾耐茝V品種，因種植時(shí)間長(zhǎng)、種植范圍廣導(dǎo)致病毒病發(fā)生嚴(yán)重[29]。本研究對(duì)不同產(chǎn)地草莓種苗檢測(cè)的品種種類和數(shù)量不同，也可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，今后會(huì)增加檢測(cè)數(shù)量，進(jìn)一步明確我國(guó)不同省市草莓種苗病毒病發(fā)生情況。

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（責(zé)任編輯：田 喆）1617EC4E-91A2-4AC0-96D3-3A8AA5458DFA