水稻種子攜帶稻瘟病菌LAMP檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

陳星 MAZNAN Nur Atiqah Binti 李志強(qiáng) 胡茂林 岳鑫璐 李健強(qiáng) 羅來鑫

摘要 稻瘟病菌Magnaporthe oryzae可通過種子帶菌實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離傳播，導(dǎo)致病害發(fā)生并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。建立靈敏高效且便于操作的水稻種子攜帶稻瘟病菌的檢測(cè)方法，是確保種子健康和控制病害發(fā)生的先決條件。本研究選取稻瘟病菌的3-磷酸甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因MoSPC3設(shè)計(jì)合成3對(duì)特異性引物，并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）方法。該方法可特異性地檢測(cè)稻瘟病菌，對(duì)稻瘟病菌DNA樣品的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.24拷貝/μL，遠(yuǎn)高于普通PCR的檢測(cè)靈敏度。將該方法用于從中國(guó)和馬來西亞不同水稻種植區(qū)收集的92份水稻種子樣品攜帶稻瘟病菌的檢測(cè)，結(jié)果顯示，LAMP方法共檢測(cè)到89份陽性樣品，而普通PCR僅顯示有2份樣品為陽性。綜上，本研究建立了一種適用于水稻種子攜帶稻瘟病菌的LAMP檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高等特點(diǎn)，豐富了稻瘟病菌的檢測(cè)體系，可用于大批量水稻種子樣品的健康檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 稻瘟病菌;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增;靈敏度;特異性;種子健康

中圖分類號(hào)： S435.111.41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021212

Abstract The fungus Magnaporthe oryzae， as the causal agent of rice blast disease， can be transmitted by rice seeds for a long distance and caused serious economic losses in rice production. To establish a sensitive， effective and convenient method for detection of M.oryzae from seeds is a precondition for rice seed health and control of rice blast disease. In this study， three primer pairs were designed based on glycerol-3-phosphate acyltransferase gene （MoSPC3） sequence of M.oryzae， and the loop-mediated isothermal amplification （LAMP） reaction system was developed. The results showed that the LAMP method was specific for detection of M.oryzae， and the sensitivity was about 0.24 copies/μL DNA， which was much more sensitive than PCR method. A total of 92 rice seed samples collected from different production areas of China and Malaysia were examined by the LAMP detection system. The results showed that 89 samples were M.oryzae positive by LAMP detection， while only two samples were detected positive by ordinary PCR. In conclusion， a LAMP system for detection of M.oryzae from rice seeds was developed， which was more convenient and more sensitive than ordinary PCR. It broadened the detection strategies for M.oryzae and could be applied for large-scale seeds health test.

Key words Magnaporthe oryzae;loop-mediated isothermal amplification;sensitivity;specificity;seed health

水稻Oryza sativa是世界上重要的糧食作物之一，是全球約半數(shù)人口的主食[1]。稻瘟病（rice blast disease）是世界性的真菌病害，也是水稻生產(chǎn)中最具毀滅性的病害之一，在全球水稻種植區(qū)普遍發(fā)生，可造成水稻產(chǎn)量損失10%～30%，嚴(yán)重威脅著水稻生產(chǎn)和糧食安全[2]。

稻瘟病的病原菌有性態(tài)為子囊菌稻間座殼菌Magnaporthe oryzae，無性態(tài)為稻梨孢菌Pyricularia oryzae [3]。稻瘟菌在水稻生長(zhǎng)的各個(gè)階段均可侵染發(fā)病，危害葉片、莖稈、穗頸、籽粒等部位。穗部發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，可造成白穗或粒癟，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量[4]。稻瘟菌可以通過孢子或菌絲等形式隨種子遠(yuǎn)距離傳播，成為田間病害的初侵染來源。在合適的溫度和濕度條件下，稻瘟菌分生孢子萌發(fā)形成芽管，芽管延伸形成附著胞，附著胞產(chǎn)生巨大膨壓形成侵染釘侵染宿主細(xì)胞，菌絲隨后沿著胞間連絲向周圍細(xì)胞擴(kuò)展，造成稻瘟病的擴(kuò)散蔓延[5-7]。稻瘟菌不僅侵染水稻，還可侵染小麥和大麥等禾本科作物[8]。

目前我國(guó)關(guān)于稻瘟病的防治，主要是以選育抗病品種為主，不同的抗病品種對(duì)稻瘟病的抗性有巨大的差異，但由于稻瘟菌生理小種較多，田間病菌變異性強(qiáng)，新培育的水稻抗病品種在種植幾年后會(huì)出現(xiàn)抗性降低或喪失的情況[9-10]。對(duì)稻瘟病的化學(xué)防治主要是采用多菌靈、三環(huán)唑等內(nèi)吸性藥劑進(jìn)行防治，但這類藥劑殘效期較長(zhǎng)，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[4]。因此，對(duì)水稻種子進(jìn)行健康檢測(cè)并使用無病菌的種子，是稻瘟病綜合防控中的重要環(huán)節(jié)。對(duì)稻瘟病菌的檢測(cè)主要包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、血清學(xué)檢測(cè)、PCR方法等，但這些方法多耗時(shí)較多或操作較為復(fù)雜，在種子帶菌檢測(cè)中需要建立一種快速靈敏、可滿足大量樣品檢測(cè)的方法[11]。B96C7615-2BEB-4A0D-B320-767E4BD38D00

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，簡(jiǎn)稱LAMP）是2000年研發(fā)的一種DNA擴(kuò)增技術(shù)[12]。該方法主要是依賴于嗜熱脂肪芽胞桿菌Bacillus stearothermophilus產(chǎn)生的Bst DNA聚合酶的鏈置換反應(yīng)活性，在擴(kuò)增過程中，將外引物合成的鏈在內(nèi)引物引導(dǎo)作用下置換下來，使反應(yīng)能夠在恒溫條件下短時(shí)間大量擴(kuò)增靶標(biāo)片段DNA，而省略了常規(guī)PCR反應(yīng)中的變性和退火階段，具有擴(kuò)增效率高、靈敏度高且易于操作等優(yōu)點(diǎn)[13]。LAMP方法目前不僅被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，還應(yīng)用于食品工業(yè)、環(huán)境樣品檢測(cè)等[12]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，LAMP方法被廣泛用于多種植物病原菌的檢測(cè)，如禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum、梨火疫病菌Erwinia amylovora、柑橘潰瘍病菌Xanthomonas citri subsp. citri、番茄細(xì)菌性潰瘍病菌Clavibacter michiganensis等[13-16]，但鮮有使用LAMP方法對(duì)稻瘟病菌進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道?；诖耍狙芯拷⒘嘶贚AMP技術(shù)的稻瘟病菌快速檢測(cè)方法，并將該方法應(yīng)用于水稻種子攜帶稻瘟病菌的檢測(cè)，豐富了現(xiàn)有的檢測(cè)體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究中所用的菌株包括10株稻瘟病菌M.oryzae，主要來自福建、廣西、云南等地，另有13株對(duì)照菌株（表1）。菌株的活化培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L，葡萄糖18 g/L，瓊脂16 g/L）。供試的水稻種子來自我國(guó)和馬來西亞不同的水稻種植省份，共采集了92個(gè)批次水稻種子樣品，其中馬來西亞水稻種子樣品4份。

1.2 真菌DNA的提取及水稻種子樣品總DNA的提取

稻瘟病菌在貼有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的2/3，刮取菌絲至2.0 mL的離心管中，液氮速凍后于全自動(dòng)組織研磨儀研磨60 s，使用基因組DNA提取試劑盒（DL-117-01，北京博邁德生物技術(shù)有限公司）提取真菌基因組DNA。

每樣品稱取10 g水稻種子，按1∶4比例加入PBS緩沖液（NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO4·12H2O 10 mmol/L，KH2PO4 2 mmol/L），28℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，富集后取1 mL使用上述基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取。

1.3 LAMP引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中報(bào)道的稻瘟病菌基因組序列，依靠基因序列比對(duì)分析，選取編碼3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶的基因MoSPC3（MGG_08194）使用在線引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V5（http：∥primerexplorer.jp/e/）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表2）。同時(shí)，基于該基因序列，使用NCBI中Primer-BLAST設(shè)計(jì)普通PCR引物作為對(duì)照（表2）。

1.4 LAMP反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化

所采用的LAMP反應(yīng)體系為25 μL。調(diào)整LAMP反應(yīng)體系中各組分的濃度，首先進(jìn)行單因素條件優(yōu)化，并進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照成分正交表L25（54）設(shè)計(jì)不同濃度組合的試驗(yàn)（表3），根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果條帶的亮度和清晰度，選取最優(yōu)的反應(yīng)體系。其中Mg2+ 6～10 mmol/L，Bst DNA聚合酶8～16 U，F(xiàn)3/B3∶FIP/BIP引物濃度比0.2∶0.8～0.2∶2.4，甜菜堿0.2～1.0 mol/L，DNA模板1 μL，條件設(shè)置為65℃，10～70 min。

1.5 LAMP引物特異性驗(yàn)證和靈敏度測(cè)試

利用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件，使用10株分離自不同地區(qū)的稻瘟病菌以及13株其他病原真菌，對(duì)LAMP引物的反應(yīng)體系的特異性進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用基于同一基因設(shè)計(jì)的稻瘟菌特異性引物MoSPC3_FP/MoSPC3_RP進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，作為L(zhǎng)AMP方法的對(duì)照。

對(duì)提取的稻瘟病菌基因組DNA，進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到10 fg/μL～10 ng/μL的DNA，進(jìn)行LAMP引物的靈敏度試驗(yàn)，同樣以上述普通PCR作為對(duì)照。

1.6 LAMP與普通PCR方法在水稻種子樣品攜帶稻瘟病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

為了驗(yàn)證LAMP方法在應(yīng)用中的可靠性，對(duì)供試的92份水稻種子樣品提取總DNA，使用本研究建立的LAMP體系和上述普通PCR方法進(jìn)行稻瘟病菌的檢測(cè)，并基于檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化

為獲得最適的LAMP反應(yīng)條件，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。首先是進(jìn)行單因素條件優(yōu)化，結(jié)果顯示，Mg2+濃度在6.0～10.0 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，都有相應(yīng)的擴(kuò)增，但在8.0 mmol/L濃度下，條帶的亮度更為明顯（圖1a），因此Mg2+最適濃度為8.0 mmol/L。

當(dāng)Bst DNA聚合酶濃度為8.0～12.0 U時(shí)，隨著濃度的升高，LAMP擴(kuò)增得到的條帶亮度逐漸升高，但聚合酶濃度再升高，條帶亮度沒有明顯變化，且條帶有彌散，因此Bst DNA聚合酶最適濃度為12.0 U（圖1b）。當(dāng)外引物濃度∶內(nèi)引物濃度為0.2∶0.8時(shí)，條帶清晰明亮，而隨著內(nèi)引物濃度的增加，條帶成彌散狀，因此外引物和內(nèi)引物的最適濃度比值為0.2∶0.8（圖1c）。甜菜堿的濃度為0.6 mol/L時(shí)擴(kuò)增條帶亮度明顯強(qiáng)于0.4 mol/L，但隨著甜菜堿濃度的增加，雖然條帶亮度增加，但彌散不清晰，因此甜菜堿的最適濃度為0.6 mol/L（圖1d）。

為了得到最優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系，考慮到各反應(yīng)成分之間的互相影響，按照表3組合進(jìn)行各條件的正交試驗(yàn)，以觀察各試劑成分的組合效果。如圖2所示，在不同組合條件下，組合5，9，13，17和21條帶清晰，并且條帶較亮，并且這些組合的引物濃度比均為0.2∶2.4，由此表明引物濃度在LAMP反應(yīng)體系中發(fā)揮較為關(guān)鍵的作用。在組合5，9，13，17和21中，組合21所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶最為清晰，且條帶亮度最大，因此，25 μL的LAMP最優(yōu)反應(yīng)體系中各組分的含量為：10.0 mmol/L Mg2+，8.0 U的Bst DNA聚合酶，引物濃度比為0.2∶2.4，0.8 mol/L的甜菜堿。B96C7615-2BEB-4A0D-B320-767E4BD38D00

基于優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系，進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化。在65℃，10～70 min的不同反應(yīng)時(shí)間條件下，30～70 min均能擴(kuò)增得到清晰的條帶，且條帶亮度沒有明顯差異（圖3）。基于反應(yīng)時(shí)間的最短化，最終選定30 min作為最適反應(yīng)時(shí)間。

2.2 LAMP引物檢測(cè)稻瘟病菌具有特異性

為了驗(yàn)證LAMP反應(yīng)引物的特異性，對(duì)供試的10株稻瘟病菌菌株和13株對(duì)照菌株進(jìn)行LAMP檢測(cè)。基于優(yōu)化好的LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，10株稻瘟病菌的檢測(cè)結(jié)果均為陽性，檢出率達(dá)到100%，而13株對(duì)照菌株的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，沒有出現(xiàn)特異性擴(kuò)增（圖4a）。同時(shí)，使用普通PCR進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果與LAMP結(jié)果一致（圖4b）。

2.3 LAMP體系檢測(cè)稻瘟病菌的靈敏度

以提取的稻瘟病菌基因組DNA為模板，LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到濃度為10 fg/μL（0.24拷貝/μL）的DNA，而普通PCR的檢測(cè)靈敏度僅為10 ng/μL（2.4×105拷貝/μL），在此條件下，LAMP檢測(cè)的靈敏度是普通PCR的106倍（圖5），明顯優(yōu)于普通PCR。

2.4 LAMP方法與普通PCR在水稻種子樣品攜帶稻瘟病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

對(duì)92批次不同來源的水稻種子樣品提取總DNA，分別使用LAMP與普通PCR進(jìn)行種子攜帶稻瘟病菌的檢測(cè)，使用稻瘟病菌基因組DNA作為陽性對(duì)照。結(jié)果顯示，92批次的水稻種子樣品中通過普通PCR檢測(cè)到2批次樣品為稻瘟病菌陽性，而LAMP檢測(cè)到89批次的水稻種子樣品為陽性（表4），且普通PCR檢出的2個(gè)陽性批次在LAMP方法檢測(cè)中均為陽性。

3 討論

近年來，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）已被廣泛應(yīng)用于微生物病原菌的快速檢測(cè)，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，其具有較高特異性，能達(dá)到快速、高效、簡(jiǎn)便地檢測(cè)病原菌的效果。稻瘟病菌作為最具危害性的十大植物病原菌之一，嚴(yán)重威脅著世界上水稻種植區(qū)的糧食安全。基于此，本研究建立了一個(gè)高效快速檢測(cè)水稻樣品中是否攜帶稻瘟病菌的LAMP方法，該方法具有反應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、不需要PCR儀等昂貴儀器的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)稻瘟病菌的檢測(cè)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

LAMP技術(shù)的高靈敏度也容易帶來由于污染而造成的假陽性的問題。為避免這一問題，本研究在操作過程中設(shè)計(jì)不同的試驗(yàn)區(qū)，進(jìn)行空間隔離，即反應(yīng)體系的配制、瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)操作避免在同一試驗(yàn)區(qū)。同時(shí)在反應(yīng)過程中，對(duì)各反應(yīng)管進(jìn)行封口膜封口，或在體系上方滴加少量的滅菌液體石蠟進(jìn)行封口，可有效避免氣溶膠污染，降低假陽性出現(xiàn)的概率。也有報(bào)道指出可在反應(yīng)體系中添加顯色染料代替瓊脂糖凝膠電泳，利用不開蓋的方式避免污染，包括SYBRGreen I、EvaGreen Dye、鈣黃綠素染料等[17]。但上述染料在本研究結(jié)果中未能達(dá)到理想結(jié)果，后續(xù)可考慮嘗試其他染料。

在LAMP反應(yīng)體系中，外引物和內(nèi)引物與靶標(biāo)基因序列互補(bǔ)，是反應(yīng)所必需的，而環(huán)引物可提高反應(yīng)效率?；诖?，在反應(yīng)條件優(yōu)化過程中，保持外引物濃度不變的情況下，優(yōu)化內(nèi)引物（FIP/BIP）濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正交優(yōu)化試驗(yàn)中，條帶亮度較亮且清晰的處理?xiàng)l件均為外引物濃度∶內(nèi)引物濃度為0.2∶2.4，表明內(nèi)外引物濃度比在反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用，但與單因素優(yōu)化結(jié)果不一致，由此表明反應(yīng)體系中的各成分之間會(huì)相互影響。同樣的結(jié)果也表現(xiàn)在Bst DNA聚合酶的添加濃度上。由于Bst DNA聚合酶與Mg2+相互作用發(fā)揮活性，在單因素優(yōu)化試驗(yàn)中，當(dāng)Mg2+濃度保持不變，增加Bst DNA聚合酶的濃度，并不能顯著提高條帶亮度。因此，在對(duì)各體系條件進(jìn)行優(yōu)化過程中，要進(jìn)行正交試驗(yàn)，基于正交試驗(yàn)的結(jié)果選擇合適的濃度，以降低各反應(yīng)成分之間的交互影響。在LAMP優(yōu)化的反應(yīng)體系中，每反應(yīng)Bst DNA聚合酶的用量達(dá)到8 U，其價(jià)格昂貴，所以應(yīng)考慮在確保反應(yīng)結(jié)果穩(wěn)定的情況下盡可能減少Bst DNA聚合酶的使用量，降低檢測(cè)成本。牛血清白蛋白（BSA）可提高反應(yīng)的靈敏度，后續(xù)可考慮在確保擴(kuò)增結(jié)果的情況下，添加BSA是否可降低Bst DNA聚合酶的使用量。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證LAMP方法的高靈敏性，我們除了利用MoSPC3基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行普通PCR驗(yàn)證比較外，同時(shí)還用了分別靶向于稻瘟病菌侵染過程的特異性基因mif23、pfh2的兩對(duì)引物作為普通PCR引物對(duì)照[18-19]，但其檢測(cè)靈敏度與檢測(cè)特異性和基于MoSPC3序列設(shè)計(jì)的引物無差異，由此說明LAMP方法的靈敏度普遍優(yōu)于普通PCR。

對(duì)于92份水稻種子樣品，通過LAMP方法檢測(cè)到89份樣品為陽性，而傳統(tǒng)PCR方法僅從來自江西和云南的種子樣品中各檢測(cè)出1份陽性結(jié)果，說明LAMP方法相較于普通PCR，具有靈敏度更高的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也表明了稻瘟病菌在中國(guó)和馬來西亞水稻種子中攜帶較為普遍，但多數(shù)種子樣品攜帶的菌量較低，因此常規(guī)PCR檢測(cè)呈陰性的樣品較多。稻瘟病菌以菌絲體和分生孢子隨病殘?bào)w越冬，成為翌年發(fā)病的初侵染源，播種帶菌種子也會(huì)造成苗瘟和葉瘟，進(jìn)而影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此要做好水稻種子健康檢測(cè)，而采用靈敏度高的檢測(cè)方法是十分必要的。

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（責(zé)任編輯：田 喆）B96C7615-2BEB-4A0D-B320-767E4BD38D00