瓜列當(dāng)致病真菌的鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)物活性研究

羅文芳 何偉 孫曉軍 周軍輝 許建軍

摘要 為篩選對(duì)瓜列當(dāng)具有良好防治效果的生防真菌，本研究從新疆加工番茄田自然發(fā)病的瓜列當(dāng)莖基部分離病原真菌，采用盆栽瓜列當(dāng)接種無(wú)菌發(fā)酵濾液原液，篩選對(duì)瓜列當(dāng)具有強(qiáng)致病性的菌株;采用共培養(yǎng)法測(cè)定菌株不同濃度無(wú)菌發(fā)酵濾液及其發(fā)酵產(chǎn)物萃取物對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的影響;利用形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行種類鑒定。結(jié)果表明：盆栽瓜列當(dāng)接種無(wú)菌發(fā)酵濾液原液可使瓜列當(dāng)植株傷口變褐，嚴(yán)重的可造成整株萎蔫死亡;菌株JTF001發(fā)酵原液對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)抑制率可達(dá)100%，25倍、50倍稀釋液抑制率分別為92.88%和87.62%;濃度為5 μg/mL和1 μg/mL JTF001發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)抑制率均達(dá)100%;濃度為0.5、0.25 μg/mL 和0.1 μg/mL 的JTF001發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的抑制率分別為91.03%、81.87%和60.04%;結(jié)合形態(tài)學(xué)和基于rpb2、tef 1和gapdh基因序列分析，將菌株JTF001鑒定為交鏈格孢Alternaria alternata。上述結(jié)果表明菌株JTF001有作為開(kāi)發(fā)防治瓜列當(dāng)生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞 瓜列當(dāng);交鏈格孢;生物防治;發(fā)酵產(chǎn)物

中圖分類號(hào)： S476;S451

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021192

Abstract The present study was to isolate fungi from the stem base of Orobanche aegyptiaca， which naturally occurred in processing tomato fields in Xinjiang， and screen the strong pathogenic strains against O.aegyptiaca by potting assay with the sterile fermentation filtrate of the strains stock solution. The activities of the sterile fermentation filtrate of the strains and extracts of its solid fermentation products against the seed germination of O.aegyptiaca were measured by using the co-cultivation method. The species of strong pathogenic strains were identified by using morphological characteristics and molecular biological method. The potting assay showed that the inoculated area turn brown after inoculation with the sterile fermentation filtrate， and the whole plant even wilted or died. The inhibition rate of the fermentation filtrate of strain JTF001 on the seed germination of O.aegyptiaca was 100%， and the 25-fold and 50-fold dilutions was 92.88% and 87.62%， respectively. The inhibition rate of the extracts of the solid fermentation products on seed germination of O.aegyptiaca was up to 100% at the concentration of 5 μg/mL or 1 μg/mL， and it was 91.03%， 81.87% and 60.04% at 0.5 μg/mL， 0.25 μg/mL or 0.1 μg/mL， respectively. Strain JTF001 was identified as Alternaria alternata based on morphological characteristics and sequence analysis of rpb2， tef 1 and gapdh. In conclusion， the above results suggested that A. alternata JTF001 had the potential to be developed as a biopesticide for the prevention of O.aegyptiaca.

Key words Orobanche aegyptiaca;Alternaria alternata;biocontrol;fermented products

瓜列當(dāng)Orobanche aegyptiaca為列當(dāng)科Orobanchaceae列當(dāng)屬Orobanche一年生草本植物。由于缺少葉片、葉綠素和功能性根，列當(dāng)完全寄生在寄主植物根系上，靠汲取寄主水分、養(yǎng)分及各類生長(zhǎng)激素來(lái)維持自身生長(zhǎng)，因此會(huì)對(duì)寄主造成嚴(yán)重危害[1]。據(jù)調(diào)查，在新疆受列當(dāng)屬植物危害的農(nóng)作物（向日葵、甜瓜、加工番茄、打瓜、辣椒等）面積為5.3萬(wàn)～6.7萬(wàn)hm2，每年給新疆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失超過(guò)5億元人民幣，且發(fā)生面積還有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢(shì)[2]。

由于列當(dāng)寄生的特殊性，對(duì)列當(dāng)進(jìn)行有效防治是當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的難題。利用列當(dāng)病原微生物研制?；詮?qiáng)、對(duì)目標(biāo)雜草以外的植物影響小、環(huán)境負(fù)效應(yīng)小且安全性高的生防菌劑，是目前防治該類雜草經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。真菌是常見(jiàn)的生物防治微生物，列當(dāng)生防微生物的研究主要集中在鐮刀菌Fusarium spp.等列當(dāng)病原菌和根瘤菌Rhizobium spp.等列當(dāng)寄主植物共生菌上[3]?？琢顣缘萚4]報(bào)道利用致病鐮刀菌Fusarium sp. L2菌株對(duì)向日葵列當(dāng)Orobanche cumana進(jìn)行田間生物防治，防治效果達(dá)92.4%，且對(duì)小麥、玉米、棉花、煙草和向日葵等作物安全。Thomas等[5]在出土向日葵列當(dāng)上接種尖孢鐮刀菌F.oxysporum的分生孢子培養(yǎng)液后，其死亡率可高達(dá)85%。尖孢鐮刀菌 FoxyⅠ和 FoxyⅡ的孢子懸浮液也可顯著降低鋸齒列當(dāng)O.crenata和分枝列當(dāng)O.ramose的萌發(fā)率及寄生率[6]。除鐮刀菌外，其他一些列當(dāng)?shù)牟≡簿哂蓄愃品莱挟?dāng)?shù)臐撃埽琔locladium botrytiss和洋蔥曲霉Aspergillus alliaceus也具有類似防除列當(dāng)?shù)淖饔肹7-8]。

為獲得對(duì)瓜列當(dāng)具有良好防治效果的真菌菌株，本研究從自然發(fā)病瓜列當(dāng)病樣中分離致病菌，采用盆栽瓜列當(dāng)接種無(wú)菌發(fā)酵濾液篩選對(duì)瓜列當(dāng)具有強(qiáng)致病性的菌株，測(cè)定其不同濃度的發(fā)酵液和發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)抑制效果，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。以期為新疆本地瓜列當(dāng)?shù)姆乐翁峁┥谰曩Y源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試種子和菌株：瓜列當(dāng)種子采自吉木薩爾縣加工番茄田自然成熟瓜列當(dāng)植株，菌株分離自吉木薩爾縣加工番茄田自然發(fā)病瓜列當(dāng)植株莖基部。

供試培養(yǎng)基：1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂12 g、蒸餾水1 000 mL;2）馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL;3）馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（potato carrot agar，PCA）：馬鈴薯20 g、胡蘿卜25 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL;4）半固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、麥芽糖40 g、酵母提取粉10 g、瓊脂4 g、蒸餾水1 000 mL;5）大米培養(yǎng)基：大米80 g、酵母粉1.2 g、蒸餾水120 mL，封口、浸泡過(guò)夜。所有培養(yǎng)基均121℃滅菌30 min。

試劑與儀器：獨(dú)腳金內(nèi)酯（GR24）購(gòu)于北京酷來(lái)博科技有限公司。真菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。DWP-9272恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。YJ-VS-2型超凈工作臺(tái)，無(wú)錫一凈凈化設(shè)備有限公司。HZQ-X500型恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。XYH-2A雙目體視顯微鏡，上海光學(xué)儀器一廠。BK5000生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物的分離與純化

采用組織分離法在自然發(fā)病瓜列當(dāng)植株病健交界處剪切0.2 cm×0.2 cm左右的組織，用70%乙醇處理1 min，3%次氯酸鈉溶液消毒3 min，無(wú)菌水連續(xù)漂洗4次，用滅菌濾紙吸干表面水分后放置在PDA培養(yǎng)基平板上，（28±2）℃ 恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3 d。挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行純化，連續(xù)純化4次，并轉(zhuǎn)接到PDA斜面試管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌株對(duì)瓜列當(dāng)?shù)闹虏⌒詼y(cè)定

將純化的供試菌株制成孢子懸浮液，采取針刺法、涂抹法和噴霧法3種方式進(jìn)行致病性測(cè)定。針刺法：用接種針蘸取孢子懸浮液，分別針刺瓜列當(dāng)?shù)幕俊⒅胁亢晚敹?涂抹法：用涂布器蘸取孢子懸浮液，分別涂抹瓜列當(dāng)植株上述3個(gè)部位，接種后用濕潤(rùn)的脫脂棉覆蓋，用噴有無(wú)菌水的密封袋罩住，保濕24 h后摘下密封袋和脫脂棉。噴霧法：噴灑500 μL孢子懸浮液在出土的瓜列當(dāng)植株上，用密封袋覆蓋瓜列當(dāng)植株保濕24 h后摘下;空白對(duì)照為無(wú)菌水，各處理及對(duì)照均為3次重復(fù)。2 d后開(kāi)始調(diào)查瓜列當(dāng)發(fā)病情況，7 d后結(jié)束調(diào)查。

1.2.3 發(fā)酵液對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的抑制作用

瓜列當(dāng)種子前期處理：將瓜列當(dāng)種子用75%乙醇消毒1.5 min，1%的次氯酸鈉消毒12 min，無(wú)菌濾紙上晾干備用。

供試菌株轉(zhuǎn)接于PDA平板中，28℃活化48 h，將活化后的菌株移至PDB培養(yǎng)基中，28℃，135 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后即為種子液。取種子液5 mL轉(zhuǎn)入裝有100 mL PDB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，28℃，135 r/min條件下振蕩培養(yǎng)120 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)濾獲得無(wú)菌發(fā)酵濾液。將40粒瓜列當(dāng)種子放置在裝有whatman濾紙（GA/A）的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入2 mL 0.05 mg/mL GR24和2 mL發(fā)酵濾液，PDB培養(yǎng)液對(duì)照處理中加入2 mL GR24和2 mL PDB，菌株發(fā)酵液和PDB分別設(shè)置為原液、25倍稀釋液和50倍稀釋液3個(gè)處理，空白對(duì)照（CK）中加入2 mL GR24和2 mL無(wú)菌水，3次重復(fù)。（25±2）℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，體視顯微鏡下觀察瓜列當(dāng)種子萌發(fā)情況并記錄萌發(fā)數(shù)量，計(jì)算抑制率。

抑制率=

空白對(duì)照種子萌發(fā)率-處理種子萌發(fā)率空白對(duì)照種子萌發(fā)率×100%。

1.2.4 菌株JTF001對(duì)番茄植株安全性測(cè)定

將菌株JTF001制成1×108個(gè)/mL的孢子懸浮液，每株番茄上分別均勻噴灑5 mL孢子懸浮液，用密封袋覆蓋番茄植株保濕24 h后摘下。以茄鏈格孢Alternaria solani 1×108個(gè)/mL的孢子懸浮液為對(duì)照;空白對(duì)照為無(wú)菌水，各處理及對(duì)照均為3次重復(fù)，3 d后開(kāi)始調(diào)查番茄植株生長(zhǎng)情況，10 d 后結(jié)束調(diào)查。

1.2.5 菌株JTF001固體發(fā)酵產(chǎn)物萃取液活性測(cè)定

將純化的生防菌株接于PDA平板上培養(yǎng)5 d，打取菌餅接種于半固體培養(yǎng)基中，28℃，135 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，即為半固體種子液;取半固體種子液5 mL轉(zhuǎn)入大米培養(yǎng)基中，（28±2）℃，恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)15 d，即得供試菌株大米固體發(fā)酵物。將大米固體發(fā)酵物進(jìn)行機(jī)械粉碎，每瓶加入240 mL乙酸乙酯浸泡，超聲萃取2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到發(fā)酵產(chǎn)物，使用時(shí)用1 mL甲醇溶解，4℃保存。

于24孔板中每孔加入40粒消毒干燥的瓜列當(dāng)種子、0.5 mL 0.05 mg/mL GR24和0.5 mL發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)酵產(chǎn)物濃度分別為5、1、0.5、0.25 μg/mL和0.1 μg/mL;甲醇對(duì)照選用0.5 mL 0.05 mg/mL GR24和0.5 mL 5 μg/mL甲醇;空白對(duì)照（CK）加入0.5 mL 0.05 mg/mL GR24和0.5 mL無(wú)菌水，每處理3次重復(fù)。25℃，遮光培養(yǎng)5 d后，體視顯微鏡下觀察記錄瓜列當(dāng)種子萌發(fā)數(shù)量。

1.2.6 菌株JTF001形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：觀察成熟菌落形態(tài)、菌絲和分生孢子大小、形態(tài)和顏色等特征，分生孢子梗的形態(tài)特征，參考《中國(guó)真菌志·鏈格孢屬》進(jìn)行分類鑒定[9]。

分子生物學(xué)鑒定：采用真菌通用引物ITS基因、RNA聚合酶Ⅱ第2大亞基基因（rpb2）、翻譯延伸因子基因（tef 1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（gapdh）特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序[10-11]，引物序列如表1所示。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O至總體積50 μL。ITS反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。rpb 2反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。tef 1反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，58℃退火55 s，72℃延伸40 s，共31個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。gapdh反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列經(jīng)NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)后，用MEGA 5軟件進(jìn)行序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用3次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株對(duì)瓜列當(dāng)致病性

通過(guò)對(duì)瓜列當(dāng)罹病植株進(jìn)行組織分離，共獲得14株真菌，盆栽接種試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，菌株JTF001發(fā)酵液針刺接種瓜列當(dāng)2 d傷口處變褐壞死，有明顯的縊縮現(xiàn)象，逐漸擴(kuò)展到整個(gè)植株，接種后7 d整株枯萎，死亡;涂抹接種后2 d植株大面積變褐、萎蔫，7 d整株干枯死亡;噴霧接種后2 d使得瓜列當(dāng)花萼變褐干枯，7 d整株枯萎死亡，而對(duì)照瓜列當(dāng)植株生長(zhǎng)狀態(tài)良好（圖1），說(shuō)明菌株JTF001對(duì)瓜列當(dāng)植株具有強(qiáng)致病性。

2.2 菌株JTF001發(fā)酵液對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的抑制作用

菌株發(fā)酵原液可完全抑制瓜列當(dāng)種子的萌發(fā)，抑制率達(dá)100%;25倍和50倍稀釋液的抑制率分別為92.88%和87.62%（表3）。菌株發(fā)酵液對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)有較好的抑制效果。

2.3 菌株JTF001對(duì)番茄植株的安全性

由圖2可知，噴灑茄鏈格孢A.solani孢子懸浮液后，番茄葉片有明顯圓形和不規(guī)則形病斑，病斑及葉片邊緣有明顯黃色暈圈;而對(duì)照組和噴灑菌株JTF001孢子懸浮液對(duì)番茄植株生長(zhǎng)未造成影響，說(shuō)明菌株JTF001對(duì)番茄植株生長(zhǎng)安全。

2.4 菌株JTF001固體發(fā)酵產(chǎn)物萃取物對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的抑制作用

發(fā)酵產(chǎn)物萃取液濃度為5 μg/mL和1 μg/mL時(shí)對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)的抑制率均為100%;濃度為0.5、0.25 μg/mL和0.1 μg/mL時(shí)對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)抑制率分別91.03%、81.87%和60.04%（表4）。從圖3可以看出，1 μg/mL處理組的瓜列當(dāng)種子沒(méi)有萌發(fā)，0.1 μg/mL處理組的瓜列當(dāng)種子芽管明顯縮短，對(duì)照組的種子芽管表面光滑，呈透明或半透明狀，萌發(fā)正常。

2.5 生防菌株形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

形態(tài)學(xué)鑒定：菌株JTF001在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d，菌落呈圓形，1～3 d時(shí)菌落為白色，3 d后顏色逐漸變?yōu)榛揖G色或褐色，外圍新生菌絲為白色，菌落呈白色與墨綠色的同心輪紋狀，菌落背面為灰白色;菌株JTF001在PCA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d，菌落初期為白色，后期中間逐漸變青褐色，菌絲發(fā)達(dá);菌株JTF001在水瓊脂培養(yǎng)基上菌落初期為褐色，后期皿中分布大量孢子，菌絲不發(fā)達(dá)。分生孢子倒棍棒形，卵形，倒梨形或近橢圓形，表面光滑，具3～6個(gè)橫隔膜，1～3個(gè)縱、斜膈膜，分隔處不縊縮或略縊縮，孢子大小（12.59～40.26） μm×（7.39～14.01） μm。短喙柱狀，淡褐色，（8.02～20.12） μm×（2.56～4.78） μm。其在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢結(jié)果顯示，菌株JTF001在PDA和PCA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量小;在水瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量極大（圖4），初步鑒定其為鏈格孢屬Alternaria spp.真菌。

分子生物學(xué)鑒定：以菌株JTF001的基因組DNA為模板進(jìn)行保守基因序列擴(kuò)增及測(cè)序，運(yùn)用真菌通用引物 ITS1 和 ITS4、RPB2-5F和fRPB2-7CR、EF1-728F和EF1-986R、GPD1 和 GPD2進(jìn)行PCR反應(yīng)分別獲得 555、967、242 bp和589 bp的片段，將菌株的擴(kuò)增序列與GenBank中序列進(jìn)行同源性比較分析，ITS序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示，菌株JTF001與鏈格孢Alternaria spp.的一致性較高;rpb 2序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示，菌株JTF001與交鏈格孢Alternaria alternata（登錄號(hào)：MK605898.1、XM-018535098.1、DQ677980.1）的一致性達(dá)99%;tef 1序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示，菌株JTF001與交鏈格孢（登錄號(hào)：KU145273.1）的一致性達(dá)98%;gapdh序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示，菌株JTF001與交鏈格孢（登錄號(hào)：MG674227.1、MK451976.1、LT707620.1）的一致性達(dá)98%。利用軟件MEGA 5中鄰接法構(gòu)建聚類分析樹(shù)狀圖，菌株JTF001和交鏈格孢均聚為同一分支（圖5、圖6、圖7），結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株JTF001鑒定為交鏈格孢Alternaria alternata。

3 討論

瓜列當(dāng)種子萌發(fā)后便形成吸器，吸附在寄主根部，通過(guò)吸收寄主的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)維持自己的生長(zhǎng)，因此，通過(guò)抑制瓜列當(dāng)種子萌發(fā)，避免瓜列當(dāng)與寄主建立寄生關(guān)系，是降低瓜列當(dāng)對(duì)寄主造成傷害的有效途徑。真菌中含有多種對(duì)瓜列當(dāng)生長(zhǎng)具有抑制作用的種類，王亞嬌等[12]從感病的列當(dāng)中分離出尖孢鐮刀菌F.oxysporum Br-2，其發(fā)酵上清液對(duì)彎管列當(dāng)O.cernua種子萌芽抑制率為71.79%;陳杰等[13]研究發(fā)現(xiàn)灰黃青霉Penicillium griseofulvum菌株CF3發(fā)酵液原液、10倍和100倍稀釋液處理后瓜列當(dāng)發(fā)芽管長(zhǎng)度與對(duì)照相比分別縮短 100.00%、68.84%和 19.24%。本研究從患病的瓜列當(dāng)莖基部分離到內(nèi)生真菌JTF001，培養(yǎng)皿試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株無(wú)菌發(fā)酵液原液、25倍稀釋液和50倍稀釋液抑制了瓜列當(dāng)?shù)姆N子萌發(fā)及萌發(fā)后瓜列當(dāng)發(fā)芽管的生長(zhǎng)。通過(guò)盆栽試驗(yàn)接種JTF001發(fā)酵液，瓜列當(dāng)植株接種處有明顯的縊縮現(xiàn)象，植株變褐色，嚴(yán)重時(shí)可使整株萎蔫死亡。

鏈格孢屬真菌物種之間的相似度極高，僅憑形態(tài)學(xué)特征很難進(jìn)行種類鑒定，因此，增加基因進(jìn)化關(guān)系作為分類依據(jù)非常有必要。Somma等[14]基于翻譯延長(zhǎng)因子基因、β-微管蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因和過(guò)敏原基因構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)引起小麥黑斑病的164個(gè)鏈格孢菌菌株進(jìn)行了鑒定，明確了菌株的種類及其進(jìn)化關(guān)系。王彩霞等[15]基于 ITS，Alt-a1 和 gpd 序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將引起葡萄葉斑病的鏈格孢鑒定為3個(gè)種。本研究采用形態(tài)學(xué)觀察并結(jié)合ITS、rpb2、tef 1和gapdh基因標(biāo)記技術(shù)對(duì)從患病瓜列當(dāng)上分離的內(nèi)生真菌JTF001進(jìn)行鑒定，將菌株JTF001鑒定為交鏈格孢Alternaria alternata。

近年來(lái)，關(guān)于利用微生物的次生代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)除草劑的研究受到廣泛的關(guān)注，并且許多研究證明，雜草?；虏【a(chǎn)生的毒素有較好的除草劑開(kāi)發(fā)潛力[16]。Zhou等[17]發(fā)現(xiàn)細(xì)交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）是防治棉田、煙田等重要雜草的一種生物除草劑。姜述君等[18]發(fā)現(xiàn)狹卵鏈格孢A. augustiovoidea產(chǎn)生的毒素對(duì)稗草的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)都有較強(qiáng)的抑制作用，在100 mg/L濃度下對(duì)稗草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)抑制率分別達(dá)100%和76%。本研究中交鏈格孢JTF001發(fā)酵產(chǎn)物萃取物在1 μg/mL濃度下對(duì)瓜列當(dāng)種子萌發(fā)抑制率達(dá)100%。目前關(guān)于鏈格孢菌防治瓜列當(dāng)?shù)膱?bào)道較少，下一步將繼續(xù)研究鏈格孢菌毒素對(duì)瓜列當(dāng)?shù)纳罊C(jī)制，有望開(kāi)發(fā)為瓜列當(dāng)?shù)纳莱輨?/p>

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（責(zé)任編輯：楊明麗）