復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因棉對斜紋夜蛾幼蟲取食行為及營養(yǎng)代謝的影響

叢勝波 許冬 楊妮娜 王玲 王金濤 劉衛(wèi)國 萬鵬

摘要 本文采用培養(yǎng)皿葉盤法和烘干法研究了常規(guī)棉‘Daiza 24C、單價抗蟲棉‘GK19和復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因抗蟲棉‘Daiza 24 對斜紋夜蛾幼蟲選擇、取食及營養(yǎng)代謝的影響。結(jié)果表明，在非選擇性條件下，雖然有較多的斜紋夜蛾1齡和3齡幼蟲在‘Daiza 24葉片上停留，但對其的取食量均顯著低于‘Daiza 24C和‘GK19，表現(xiàn)出明顯的拒食現(xiàn)象。在可選擇條件下，取食‘Daiza 24的1齡和3齡幼蟲比例均隨時間延長呈逐漸下降趨勢，對‘Daiza 24葉片表現(xiàn)出顯著忌避行為，趨向于取食‘Daiza 24C和‘GK19?！瓺aiza 24對斜紋夜蛾3齡幼蟲的相對生長率、相對取食量、食物利用率、食物轉(zhuǎn)化率、近似消化率均存在顯著影響，而對5齡幼蟲，取食‘Daiza 24的幼蟲除相對生長率和相對取食量顯著低于取食‘Daiza 24C‘GK19的幼蟲外，其他營養(yǎng)指標(biāo)在取食不同品種間差異均不顯著。以上研究結(jié)果表明，斜紋夜蛾1齡和3齡幼蟲對‘Daiza 24表現(xiàn)出顯著的拒食和忌避行為，‘Daiza 24對斜紋夜蛾低齡幼蟲的營養(yǎng)代謝存在顯著影響，但對高齡幼蟲營養(yǎng)代謝的影響較弱。

關(guān)鍵詞 復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因棉花;斜紋夜蛾;取食行為;營養(yǎng)代謝

中圖分類號： S435.622

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021236

Abstract The effects of conventional cotton ‘Daiza 24C， transgenic cotton ‘GK19 and stacked genetically modified cotton ‘Daiza 24 on feeding， host-selection behavior and nutrient metabolism of Spodoptera litura larvae were studied by using petri dish method and oven drying method. The results of non-choice experiments showed that although there were more 1st- and 3rd-instar larvae of S.litura stayed on the leaves of ‘Daiza 24， but their food intake was significantly lower than that of the larvae feeding on ‘Daiza 24C and ‘GK19， showing obvious antifeeding phenomenon. The choice experiments results demonstrated that the percentage of the 1st- and 3rd-instar larvae feeding on ‘Daiza 24 decreased gradually with the time， and the larvae tended to choose ‘Daiza 24C and ‘GK19. Feeding on ‘Daiza 24 had significant effects on the relative growth rate， relative food intake， food utilization efficiency， food conversion rate and approximate digestibility of the 3rd-instar larvae. However， there were no significant differences in other nutritional indexes among larvae feeding on three hosts for 5th-instar larvae， except for the relative growth rate and relative food intake. In summary the 1st- and 3rd-instar larvae of S.litura showed significant antifeeding and avoidance behaviors to ‘Daiza24. ‘ Daiza24 had significant effects on the nutrient metabolism of young larvae of S.litura， but weak effect on older larvae.

Key words stacked genetically modified cotton;Spodoptera litura;feeding behavior;nutrient metabolism

目前我國大面積商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物為棉花，20多年的種植使田間棉鈴蟲Helicoverpa armigera、紅鈴蟲Pectinophora gossypiella等靶標(biāo)害蟲得到了有效的控制，減少了化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，已成為棉田害蟲綠色生態(tài)防控中的一項重要措施[1-4]。然而相關(guān)研究表明，轉(zhuǎn)Bt基因棉花的長期種植使田間靶標(biāo)害蟲在持續(xù)高壓汰選下，對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生了不同程度的抗性，同時斜紋夜蛾Spodoptera litura、盲蝽等非靶標(biāo)害蟲的為害呈逐漸加重趨勢，成為當(dāng)前急需探索和迫切解決的科學(xué)問題[5-8]。

為提高殺蟲效率，拓寬殺蟲譜，具有2～3種復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物目前已成為一個重要的研發(fā)及推廣方向。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）最新報告， 2019年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植面積達(dá)1.904億hm2，復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達(dá)到7 766萬hm2，較2018年增加了6%，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的45%，其中全球約有12%的地區(qū)種植了含抗蟲性狀的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物[9]。C8E55514-531D-42F5-A73B-86BE2AFDB859

復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對斜紋夜蛾、棉鈴蟲、紅鈴蟲、甜菜夜蛾Spodoptera exigua等害蟲具有比較高的防治效果，并能有效延緩其對Bt基因作物的抗性進(jìn)化[10-13]。然而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲、歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis、甜菜夜蛾對含Bt殺蟲蛋白的食物具有主動忌避能力[14-16]。害蟲主動拒食對其有毒或含毒素高的食物，傾向選擇無毒或含毒素低的食物，對不同毒素或作物選擇行為反應(yīng)亦不同，表現(xiàn)出不同程度的行為抗性[17-18]。

斜紋夜蛾是一種多食性的遷飛性害蟲，幼蟲3齡后分散為害寄主作物，在田間具有比較強的轉(zhuǎn)移能力，其對Bt基因作物的取食行為反應(yīng)可能影響復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的應(yīng)用效果。國內(nèi)外已有一些復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因棉對斜紋夜蛾防治效率的相關(guān)報道，而關(guān)于復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因棉對斜紋夜蛾幼蟲選擇行為及營養(yǎng)生理的影響研究甚少。鑒于此，本研究以復(fù)合性狀抗蟲棉‘Daiza 24、單價抗蟲棉‘GK19、常規(guī)棉‘Daiza 24C為研究對象，分析3種不同類型棉花品種對斜紋夜蛾幼蟲的取食選擇行為及營養(yǎng)代謝的影響，為我國新型轉(zhuǎn)基因棉花環(huán)境安全評價及害蟲可持續(xù)治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

斜紋夜蛾卵塊由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)條件為溫度26～28℃，濕度60%～70%，L∥D=13 h∥11 h。用人工飼料[19]飼養(yǎng)初孵幼蟲至試驗蟲齡，取生長一致的幼蟲做為供試蟲源。

1.2 供試棉花品種及種植

供試棉花：抗蟲抗除草劑復(fù)合性狀棉雜交種‘Daiza 24（Cry1Ac+Cry2Ab2+CP4-epsps）和非轉(zhuǎn)基因同型對照雜交種‘Daiza 24C，除轉(zhuǎn)基因性狀外，兩者具有相同的遺傳背景，種子均由美國Monsanto公司提供。當(dāng)?shù)刂髟訡ry1A單價抗蟲棉‘GK19種子由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥所棉蟲組提供。

棉花種植管理：試驗在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所新洲試驗基地（30°29N， 114°18E）進(jìn)行。4月中旬營養(yǎng)缽播種，5月上旬移栽，棉花種植株行距為0.4 m×1 m，每個品種種植面積為200 m2。各品種在整個生育期不施用任何殺蟲劑，其他為常規(guī)管理。試驗地周圍設(shè)有150 m 以上的非棉花隔離區(qū)。

1.3 試驗方法

1.3.1 非選擇性試驗

采用培養(yǎng)皿葉盤法。在直徑14 cm 的玻璃培養(yǎng)皿底鋪1張濕潤的濾紙，沿四周放入6片直徑為1 cm 的同種棉花的心葉圓片，間距相同，然后在濾紙中央接入10頭饑餓6 h的斜紋夜蛾1齡或3齡幼蟲。接蟲后立即用1層黑棉布和1層紅棉布遮光，移入（27±1）℃、RH（80±10）%、L∥D=14 h∥10 h的養(yǎng)蟲室。分別在接蟲后第1、2、4、6、8、10、12、24、36 h檢查幼蟲所在位置（葉片、培養(yǎng)皿壁或濾紙）、幼蟲存活數(shù)，計算在不同品種棉花葉片上取食的幼蟲百分率，用取食選擇率[20]表示。每處理5次重復(fù)。取食36 h后，分別對各處理幼蟲稱重，同時記錄斜紋夜蛾幼蟲取食的葉片面積，葉片面積測量參考湯清波等的方法[21]。

1.3.2 選擇性試驗

將1張濾紙折成4 等份，濕潤后放入直徑14 cm的玻璃培養(yǎng)皿底部，分別交替等距放置直徑為1 cm的‘Daiza 24‘GK19和‘Daiza 24C的葉圓片共6片。飼養(yǎng)條件、調(diào)查時間同上，每處理15次重復(fù)。取食36 h后，分別記錄斜紋夜蛾幼蟲取食各種棉花葉片的面積，利用改進(jìn)的Jermy葉碟法計算取食選擇指數(shù)[21]。

取食選擇指數(shù)=取食某種植物葉片的面積/參試植物葉片的總?cè)∈趁娣e。

取食選擇指數(shù)將介于0～1之間，數(shù)值越大表示對某種植物的趨性（嗜好性）越強，數(shù)值越小則表示對該種植物的忌避性越強。

1.4 斜紋夜蛾幼蟲營養(yǎng)代謝指標(biāo)測定

選取剛蛻皮生長一致的斜紋夜蛾3齡和5齡幼蟲各10頭，饑餓6 h后稱其鮮重，分別

放入直徑6 cm、高3 cm的圓形養(yǎng)蟲盒中單頭飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為（27±1）℃、RH（80±10）%、L∥D=14 h∥10 h。

定量飼喂3種棉花葉片。24 h后取出剩余食物，將幼蟲饑餓6 h讓其排空糞便后，稱其鮮重。而后將幼蟲、糞便及剩余棉花葉片在80℃下烘干至恒重，再分別稱其干重。每處理重復(fù)3次。測定各品種棉花葉片的干濕比，飼后幼蟲干濕比，以推算飼喂前棉花葉片和幼蟲的干重。依據(jù)下列公式計算各營養(yǎng)指標(biāo)[22]：

幼蟲相對生長率=G/（B×t）;

幼蟲相對取食量= I/（B×t）;

食物利用率=G/I ×100%;

食物轉(zhuǎn)化率=G/（I-F） ×100%;

近似消化率= （I-F）/I ×100%。

式中， G為蟲體增重（即G =飼后幼蟲干重- 飼前幼蟲干重）;I為幼蟲的取食量（即I =飼前棉花葉片干重- 飼后棉花葉片干重）;F為排泄物（糞便）干重;B 為試驗期間幼蟲的平均體重[即B = （飼前幼蟲干重+飼后幼蟲干重）/2];t為試驗天數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以上所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel、SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，并采用Duncan氏新復(fù)極差法比較不同處理間相關(guān)生物學(xué)參數(shù)的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 非選擇性試驗

接蟲后1 h，斜紋夜蛾1齡幼蟲在‘GK19‘Daiza 24‘Daiza 24C 3種棉花葉片上的取食選擇率分別為78%、74%、80%，后隨時間延長呈逐漸上升趨勢。第6～12 h，1齡幼蟲在3種棉花葉片上的取食選擇率均保持在94%以上。12 h后，3種棉葉上取食選擇率逐漸下降。在非選擇取食過程中，斜紋夜蛾1齡幼蟲對3個棉花品種葉片的取食選擇率差異不顯著（P>0.05）（圖1）。C8E55514-531D-42F5-A73B-86BE2AFDB859

斜紋夜蛾3齡幼蟲對‘GK19和‘Daiza 24C 2種棉葉的幼蟲取食選擇率均隨時間延長逐漸上升，到第8 h時， ‘Daiza 24C上的幼蟲取食選擇率達(dá)到最高，為87.5%，‘GK19上的幼蟲取食選擇率則在第12 h達(dá)到最高，為91.79%。幼蟲對‘Daiza 24的取食選擇率在第2 h時達(dá)到峰值（80%）后呈現(xiàn)下降趨勢（圖2），至第24 h時，對‘Daiza 24的取食選擇率與對照‘GK19相比差異顯著（P<0.05）。其余觀測時間3個棉花品種間的取食選擇率均差異不顯著（P>0.05）。

分別用‘Daiza 24飼喂斜紋夜蛾1齡和3齡幼蟲36 h后，幼蟲體重和取食葉面積均顯著低于用‘GK19和‘Daiza 24C飼喂處理（P<0.05）?！瓽K19與‘Daiza 24C兩者間差異不顯著（P>0.05）（表1）?？梢?，斜紋夜蛾1齡和3齡幼蟲在非選擇性取食過程中，斜紋夜蛾幼蟲雖大多停留在‘Daiza 24葉片上，但取食量很少，表現(xiàn)出顯著拒食現(xiàn)象。

2.2 選擇性試驗

由圖3可見，接蟲后1 h，斜紋夜蛾1齡幼蟲在3種棉葉上的取食選擇率差異不顯著（P>0.05）。第2～36 h，復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因棉‘Daiza 24上的幼蟲取食選擇率呈逐漸下降趨勢?！瓺aiza 24C上的幼蟲取食選擇率隨時間的延長逐漸增加，到第8 h時達(dá)到最高值，為46.7%，隨后又逐漸下降。兩者間差異顯著（P<0.05）。斜紋夜蛾在‘GK19上的取食選擇率介于兩者之間。表明斜紋夜蛾1齡幼蟲在取食過程中，對3種棉花葉片表現(xiàn)出顯著的主動選擇行為，選擇順序為‘Daiza 24C>‘GK19>‘Daiza 24。

3齡幼蟲在‘Daiza 24葉片上的取食選擇率，隨時間延長逐漸下降，在第6～24 h，與在‘GK19和‘Daiza 24C葉片上的取食選擇率差異顯著（P<0.05）。在‘GK19和‘Daiza 24C上的取食選擇率隨時間延長逐漸上升，到第12 h達(dá)到最高值，分別為40.7%和37.3%，隨后下降，整個取食過程兩者間差異不顯著（P>0.05）（圖4）。

由表2可見，斜紋夜蛾1齡和3齡幼蟲對棉花‘Daiza 24葉片的取食面積與‘GK19和‘Daiza 24C相比差異極顯著（P<0.01）。斜紋夜蛾幼蟲趨向于選擇‘GK19和‘Daiza 24C取食，對‘Daiza 24表現(xiàn)極顯著的忌避性。

2.3 營養(yǎng)代謝指標(biāo)的測定

由表3可見，與‘GK19和‘Daiza 24C相比，‘Daiza 24對斜紋夜蛾3齡幼蟲的相對生長率、相對取食量、食物利用率、食物轉(zhuǎn)化率、近似消化率各方面營養(yǎng)指標(biāo)均存在顯著影響（P<0.05）。表4顯示，‘Daiza 24對斜紋夜蛾5齡幼蟲的相對生長率、相對取食量的影響顯著（P<0.05），但對其食物利用率、食物轉(zhuǎn)化率、近似消化率影響不顯著（P>0.05）。

3 討論

在昆蟲與植物長期的互作進(jìn)程中，植株內(nèi)產(chǎn)生的功能性代謝物質(zhì)會對昆蟲的行為、生理等各方面產(chǎn)生直接影響，并迫使其做出相應(yīng)的生存策略調(diào)整，以提高其耐受性，從而順利完成種群的繁衍[23-26]。轉(zhuǎn)Bt基因作物導(dǎo)致害蟲表現(xiàn)出的拒食行為，會直接影響靶標(biāo)害蟲攝入Bt殺蟲蛋白的量，最終影響其田間實際防治效果。本研究結(jié)果顯示，強迫取食條件下，斜紋夜蛾1齡和3齡幼蟲雖然大多數(shù)都停留在3種棉花葉片上，但對‘Daiza 24棉葉取食面積最少，表現(xiàn)出了顯著的拒食現(xiàn)象。表明斜紋夜蛾幼蟲不僅能識別復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因棉葉片，還能主動規(guī)避含殺蟲蛋白的棉花葉片。這與已報道的粉紋夜蛾Trichoplusia ni、棉鈴蟲、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis、煙芽夜蛾Helicoverpa assulta等鱗翅目昆蟲能發(fā)現(xiàn)并規(guī)避含Bt蛋白的飼料和轉(zhuǎn)基因植物的研究結(jié)果相一致[17，27-29]。

在可選擇條件下，斜紋夜蛾1齡幼蟲對3種不同棉花葉片表現(xiàn)出顯著的主動選擇性。即1齡幼蟲優(yōu)先選擇常規(guī)棉‘Daiza 24C，其次選擇轉(zhuǎn)基因棉花。這可能由于1齡幼蟲對Bt蛋白的反應(yīng)相對比較敏感，會優(yōu)先選擇對自身無毒害的食物，其次選擇毒素含量少的食物。而3齡幼蟲在第1～2 h時，對‘Daiza 24的選擇性最高，‘GK19和‘Daiza 24C次之。2 h后才逐漸轉(zhuǎn)向選擇‘GK19和‘Daiza 24C取食。這可能是3齡幼蟲取食量和蟲體較大，取食轉(zhuǎn)Bt基因作物后，當(dāng)體內(nèi)的Bt蛋白量積累到一定閾值，才會做出相應(yīng)的行為反應(yīng)。相關(guān)研究表明，斜紋夜蛾和棉鈴蟲取食含Bt殺蟲蛋白的飼料和作物后，對低齡幼蟲的爬行能力和擴散均具有明顯的控制作用，但對高齡幼蟲的控制作用不大，甚至還有利于其擴散，低齡幼蟲比高齡幼蟲表現(xiàn)更敏感[18，30-31]，這與本研究結(jié)果比較一致。‘Daiza 24對3齡斜紋夜蛾幼蟲的相對生長率、相對取食量、食物利用率、食物轉(zhuǎn)化率、近似消化率各項營養(yǎng)代謝指標(biāo)均存在顯著影響，而對5齡斜紋夜蛾幼蟲，除相對生長率和相對取食量外，其他3項營養(yǎng)代謝指標(biāo)影響不顯著。

復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對斜紋夜蛾幼蟲的取食行為及腸道的吸收、營養(yǎng)轉(zhuǎn)化均產(chǎn)生了顯著影響，從而直接影響其幼蟲的生長、繁育。但隨蟲齡的不斷升高，影響作用趨向減弱。相關(guān)研究結(jié)果表明，斜紋夜蛾3齡幼蟲取食表達(dá)Cry1ac+Cry2ab雙價抗蟲棉死亡率僅為30%～35%，4齡和5齡幼蟲可全部存活[32]。由于斜紋夜蛾寄主廣泛，3齡后分散為害，轉(zhuǎn)移能力強。相鄰非轉(zhuǎn)Bt基因寄主作物上生長發(fā)育的斜紋夜蛾高齡幼蟲很有可能遷移到Bt棉田內(nèi)進(jìn)行為害，這將會大大降低其對斜紋夜蛾的控制效果，增加了Bt抗性的上升幾率。因此應(yīng)針對不同生態(tài)區(qū)的作物布局制定相應(yīng)的預(yù)警和防治策略，運用IPM理論進(jìn)行害蟲綜合治理，從而更好地發(fā)揮新型轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的控害效果。C8E55514-531D-42F5-A73B-86BE2AFDB859

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（責(zé)任編輯：楊明麗）C8E55514-531D-42F5-A73B-86BE2AFDB859