禾谷鐮孢FgCYP51B蛋白F511L突變對(duì)分生孢子產(chǎn)量及其對(duì)烯唑醇敏感性的影響

孫曉梅 趙彥翔 遲夢(mèng)宇 黃金光

摘要 Phe511是禾谷鐮孢甾醇-14α-脫甲基酶FgCYP51B活性口袋中的一個(gè)重要氨基酸。本研究中，我們探究了FgCYP51B蛋白中該位點(diǎn)突變后對(duì)禾谷鐮孢主要生物學(xué)表型的影響，并通過(guò)分子對(duì)接探討了可能的原因。結(jié)果表明禾谷鐮孢FgCYP51B-F511L突變體在菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率等表型上與野生型菌株P(guān)H-1沒(méi)有明顯差異。但是F511L突變導(dǎo)致分生孢子的產(chǎn)量嚴(yán)重降低，對(duì)烯唑醇的敏感性增強(qiáng)。分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)突變后亮氨酸的長(zhǎng)側(cè)鏈?zhǔn)沟孟┻虼嫉募谆l(fā)生扭轉(zhuǎn)，側(cè)鏈朝向發(fā)生改變，更有利于與蛋白受體形成較強(qiáng)的疏水作用，這可能是導(dǎo)致FgCYP51B-F511L突變體對(duì)烯唑醇敏感性增強(qiáng)的原因。

關(guān)鍵詞 禾谷鐮孢;CYP51B;點(diǎn)突變;生物學(xué)表型;藥劑敏感性

中圖分類(lèi)號(hào)： S431

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021222

Abstract Phenylalanine 511 is an important amino acid residue in the active pocket of FgCYP51B，a sterol 14α-demethylase in Fusarium graminearum. In this study， we investigated the effect of the F511L mutation in FgCYP51B on its biological phenotypes. The results showed that the colony morphology and growth rate of the FgCYP51B-F511L mutant were consistent with those of the wild type strain PH-1. However， the F511L mutation led to significant reduction in conidia and increased sensitivity to diniconazole compared with the wild type strain. Molecular docking indicated that the F511L mutation made the methyl group of diniconazole twisted and changed the direction of the side chain of diniconazole， which facilitates strong hydrophobic interaction between diniconazole with the protein receptor. It may be the reason why FgCYP51B-F511L mutant is more sensitive to diniconazole than wild type strain.

Key words Fusarium graminearum;CYP51B;point mutation;biological phenotype;fungicide sensitivity

禾谷鐮孢Fusarium graminearum是全世界各小麥產(chǎn)區(qū)中小麥赤霉病（Fusarium head blight，F(xiàn)HB）最主要的致病菌[1]。由其引起的小麥赤霉病不僅會(huì)造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，病原菌產(chǎn)生的真菌毒素還會(huì)污染谷物，導(dǎo)致谷物品質(zhì)下降，并且會(huì)嚴(yán)重危害人畜健康[2-3]。2012年分子植物病理學(xué)期刊（Molecular Plant Pathology）評(píng)選的十大植物病原真菌中禾谷鐮孢名列第4位[2]。小麥赤霉病是典型的氣候型流行性病害。目前，在小麥揚(yáng)花期使用殺菌劑噴霧防治是最有效的防治方法，常用的殺菌劑有苯并咪唑類(lèi)殺菌劑（MBCs）、甾醇脫甲基抑制劑（DMIs）、氰烯菌酯（JS399-19）及其復(fù)配劑等。但是，由于藥劑的不合理使用，目前已經(jīng)出現(xiàn)了對(duì)MBCs及DMIs產(chǎn)生抗性的禾谷鐮孢田間菌株[4-5]。室內(nèi)藥劑馴化試驗(yàn)等也表明禾谷鐮孢對(duì)氰烯菌酯較易產(chǎn)生抗性突變[6-7]。因此加強(qiáng)對(duì)禾谷鐮孢的田間監(jiān)測(cè)以及研發(fā)新型殺菌劑對(duì)于有效防控小麥赤霉病具有重要意義。

DMIs的靶標(biāo)蛋白是病原真菌的甾醇-14α-脫甲基酶（CYP51）。其作用機(jī)理主要是通過(guò)抑制該酶的活性阻斷真菌細(xì)胞膜主要成分麥角甾醇的合成，同時(shí)造成大量有害中間產(chǎn)物的積累，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能。目前研究表明病原真菌主要通過(guò)CYP51中氨基酸點(diǎn)突變、CYP51基因的過(guò)量表達(dá)以及編碼外排泵基因的過(guò)量表達(dá)等方式對(duì)DMIs藥劑產(chǎn)生抗性，而氨基酸點(diǎn)突變是植物病原菌對(duì)DMIs產(chǎn)生抗性的主要機(jī)制[8-9]。導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生的突變位點(diǎn)主要集中在CYP51蛋白N端和C端，這些位點(diǎn)通常參與構(gòu)成藥劑與蛋白互作口袋[10]。在禾谷鐮孢中存在3個(gè)編碼CYP51蛋白的基因，其中FgCYP51B編碼功能性甾醇-14α-脫甲基酶。通過(guò)同源建模和分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gCYP51B與DMIs藥劑分子的結(jié)合口袋主要由Val136、Tyr137、Ala308、Ser312、Ile374和Phe511等6個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成[11]。課題組前期通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，將FgCYP51B第137位酪氨酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，并測(cè)定了野生型菌株和突變株對(duì)戊唑醇等甾醇脫甲基抑制劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)第137位酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸后對(duì)戊唑醇的敏感性降低，分生孢子產(chǎn)量降低，子囊孢子的發(fā)育受阻[12-13]。目前的研究表明N端第123位酪氨酸、第137位酪氨酸等在FgCYP51B蛋白抗藥性及生物學(xué)功能方面承擔(dān)重要角色[12，14]，但是C端氨基酸在殺菌劑敏感性方面的研究相對(duì)較少。2014年有研究發(fā)現(xiàn)指梗青霉Penicillium digitatum PdCYP51B中與FgCYP51B的Phe511等價(jià)的Phe506發(fā)生F506I突變及G459S突變?cè)谥腹Ｇ嗝箤?duì)咪鮮胺產(chǎn)生中等抗性中發(fā)揮作用[15]。

為探究禾谷鐮孢C端511位苯丙氨酸在FgCYP51B發(fā)揮功能中的作用，本研究構(gòu)建了FgCYP51B 蛋白的F511L突變體，并對(duì)突變體的菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率、分生孢子產(chǎn)量等生物學(xué)表型特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)FgCYP51B第511位苯丙氨酸突變后嚴(yán)重影響禾谷鐮孢孢子發(fā)育以及其對(duì)烯唑醇?xì)⒕鷦┑拿舾行?。使用同源建模和分子?duì)接分析了可能的原因，試驗(yàn)結(jié)果也為設(shè)計(jì)防治小麥赤霉病新型殺菌劑提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用菌株、載體：大腸桿菌Escherichia coli DH5α，禾谷鐮孢野生型菌株P(guān)H-1、FgCYP51B敲除體（ΔFgCYP51B）、回補(bǔ)體（ComCYP51B）、互補(bǔ)載體pKN-FgCYP51B-Com由本實(shí)驗(yàn)室保存，基因回補(bǔ)載體pKN由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)楊俊教授惠贈(zèng)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g切丁后煮沸20 min，過(guò)濾后濾液加葡萄糖20 g，去離子水定容至1 L，添加1.5%（m/V）瓊脂粉。1%綠豆培養(yǎng)基（mung bean broth，MBB）： 10 g綠豆于水中煮沸20 min后過(guò)濾，濾液定容至1 L。水瓊脂（water agar，WA）培養(yǎng)基：向去離子水中加入2.0%（m/V）的瓊脂粉。培養(yǎng)基均高溫滅菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)藥劑：98%烯唑醇原藥由青島中達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。試驗(yàn)中用DMSO配制成有效成分濃度為1 000 μg/mL的母液備用。

1.2 CYP51B基因突變載體pKN-FgCYP51B-F511L的構(gòu)建

以互補(bǔ)載體pKN-FgCYP51B-Com為模板，利用重疊延伸PCR的方法[12]制備突變片段，定點(diǎn)突變引物見(jiàn)表1。利用引物F511L-F和F511L-mutR擴(kuò)增FgCYP51B-F511L突變片段上游序列，用引物F511L-mutF和F511L-R擴(kuò)增FgCYP51B-F511L突變片段下游序列。通過(guò)引物F511L-F和F511L-R對(duì)F511L突變上、下游序列進(jìn)行融合PCR。通過(guò)限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ對(duì)突變片段FgCYP51B-F511L和pKN載體進(jìn)行雙酶切，利用T4連接酶將突變片段和pKN載體進(jìn)行連接。熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，將菌液PCR驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序確認(rèn)。提取質(zhì)粒，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選、驗(yàn)證

使用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pKN-FgCYP51B-F511L轉(zhuǎn)化到禾谷鐮孢FgCYP51B敲除體菌株（ΔFgCYP51B）中。具體的轉(zhuǎn)化方法

及轉(zhuǎn)化子的篩選、驗(yàn)證方法參照Qian等的方法[12]，驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子保存在30%的甘油中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率及分生孢子產(chǎn)量測(cè)定

打取禾谷鐮孢野生型菌株P(guān)H-1、FgCYP51B敲除體、回補(bǔ)體及FgCYP51B-F511L突變體菌株菌絲塊，置于PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗下培養(yǎng)72 h。觀察菌落形態(tài)，采用十字交叉法測(cè)量菌落大小。在1%綠豆培養(yǎng)基中于25℃、200 r/min條件下培養(yǎng)進(jìn)行分生孢子的誘導(dǎo)。雙層擦鏡紙過(guò)濾收集分生孢子，25℃，4 000 r/min離心，1 mL無(wú)菌水懸浮分生孢子，血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)。

1.5 F511L突變體對(duì)烯唑醇敏感性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定FgCYP51B-F511L突變體、野生型PH-1、FgCYP51B敲除體及回補(bǔ)體菌株對(duì)烯唑醇的敏感性變化[12]。試驗(yàn)中使用的烯唑醇藥劑濃度為0、0.13、0.25、0.50、1.0、2.0 mg/L。利用以下公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率：菌絲生長(zhǎng)抑制率 =（對(duì)照菌落直徑 - 處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑 - 菌餅直徑）×100%。使用SPSS軟件進(jìn)行概率回歸分析計(jì)算得到抑制中濃度EC50[16]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行單因素方差分析后，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

1.7 同源建模和分子對(duì)接

FgCYP51B三維結(jié)構(gòu)的同源建模以及其與烯唑醇的分子對(duì)接試驗(yàn)在四川魔德科技有限公司進(jìn)行。方法簡(jiǎn)述如下，通過(guò)BLASTP程序檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank），得到與FgCYP51B序列一致性為61%的4UYL晶體結(jié)構(gòu)[17]，以此結(jié)構(gòu)為模板用SWISS-MODEL程序[18]對(duì)FgCYP51B同源建模，使用PROCHECK[19]和QMEAN程序[20]對(duì)蛋白模型進(jìn)行合理性評(píng)價(jià)。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件處理獲得的FgCYP51B蛋白和烯唑醇（diniconazole， DIN）配體結(jié)構(gòu)，然后使用AutoDock 4.2.6軟件包進(jìn)行分子對(duì)接。首先設(shè)定血紅素附近為配體的結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)gCYP51B及突變體對(duì)接口袋中心點(diǎn)坐標(biāo)設(shè)為（-80.593， 158.870， -8.968），對(duì)接盒子X(jué)YZ各方向的格點(diǎn)數(shù)設(shè)為40×40×40，格點(diǎn)間距為0.375 ，對(duì)接次數(shù)設(shè)為200，其余參數(shù)采用默認(rèn)值。能量?jī)?yōu)化采用Amber14力場(chǎng)，進(jìn)行兩步優(yōu)化：先進(jìn)行5 000步的最陡下降法優(yōu)化，再用3 000步的共軛梯度法對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，將最終的結(jié)果作為后續(xù)分析的模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 pKN-FgCYP51B-F511L突變載體的構(gòu)建

以互補(bǔ)載體pKN-FgCYP51B-Com為模板，通過(guò)PCR分別擴(kuò)增得到FgCYP51B-F511L突變片段的5′端和3′端約3.2 kb、570 bp的片段（圖1）。將突變片段的5′端和3′端片段進(jìn)行融合PCR，獲得大約4.0 kb的目標(biāo)片段。然后將融合片段酶切后連接到pKN載體上，利用FgCYP51B基因的特異性引物F511L-CheckF、F511L-CheckR對(duì)突變載體進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證（圖2），測(cè)序結(jié)果顯示，F(xiàn)gCYP51B基因編碼序列的第1 533位核苷酸C突變?yōu)锳，對(duì)應(yīng)511位氨基酸由苯丙氨酸F突變?yōu)榱涟彼酟。

2.2 禾谷鐮孢FgCYP51B-F511L突變菌株驗(yàn)證pKN-FgCYP51B-F511L

轉(zhuǎn)化到禾谷鐮孢FgCYP51B敲除體菌株中后，經(jīng)潮霉素和G418雙抗篩選得到突變體轉(zhuǎn)化子，單孢分離后提取轉(zhuǎn)化子DNA。用載體特異性引物M13-20-F、M13-R對(duì)F511L轉(zhuǎn)化子進(jìn)行檢測(cè)。F511L的2個(gè)轉(zhuǎn)化子中均檢測(cè)到約4 100 bp特異性條帶（圖3）。

2.3 FgCYP51B第511位氨基酸突變（F511L）對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響

利用1%綠豆培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株并進(jìn)行分生孢子產(chǎn)量的測(cè)定。通過(guò)GraphPad Prism軟件對(duì)FgCYP51B-F511L突變體和野生型菌株P(guān)H-1、FgCYP51B基因敲除體ΔFgCYP51B以及FgCYP51B回補(bǔ)體ComCYP51B分生孢子產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，PH-1與ComCYP51B的分生孢子產(chǎn)量無(wú)顯著差異，測(cè)量平均值分別為2.3×106、2.2×106個(gè)/mL。

但是ΔFgCYP51B與FgCYP51B-F511L突變體的產(chǎn)孢量分別為0.8×106、1.5×106個(gè)/mL，與野生型相比產(chǎn)孢量顯著下降（P<0.05）（圖4）。這說(shuō)明FgCYP51B基因與禾谷鐮孢分生孢子產(chǎn)量有關(guān)，與Fan等報(bào)道一致[23]。而且CYP51B基因C端第511位苯丙氨酸在分生孢子產(chǎn)生過(guò)程中也起著重要的作用，但是FgCYP51B第511位氨基酸突變后對(duì)禾谷鐮孢的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)沒(méi)有影響（圖5），這與Fan等報(bào)道FgCYP51B基因并不是禾谷鐮孢營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的必需基因相一致[23]。

2.4 突變體對(duì)烯唑醇的敏感性

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定禾谷鐮孢野生型菌株P(guān)H-1、FgCYP51B基因敲除體、FgCYP51B基因回補(bǔ)體以及FgCYP51B-F511L突變菌株對(duì)烯唑醇的敏感性差異，利用SPSS軟件計(jì)算各自的EC50（表2）。比較4個(gè)菌株對(duì)烯唑醇的敏感性差異，其中FgCYP51B基因敲除及回補(bǔ)后對(duì)烯唑醇的敏感性與野生型禾谷鐮孢相比僅略有下降，而FgCYP51B-F511L突變菌株對(duì)烯唑醇的敏感性則比野生型禾谷鐮孢明顯升高。在同一藥劑濃度下，F(xiàn)511L突變菌株的菌落直徑明顯小于野生型禾谷鐮孢菌落，尤其在高濃度時(shí)菌落直徑差異明顯。由表2可知烯唑醇對(duì)F511L突變體的EC50比對(duì)野生型的EC50降低了約58%。這說(shuō)明FgCYP51B蛋白第511位氨基酸在FgCYP51B與烯唑醇的互作過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用。

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

將烯唑醇（DIN）分別對(duì)接到FgCYP51B、FgCYP51B-F511L的催化活性中心，得到的結(jié)合能分別為-7.44 kcal/mol和-7.65 kcal/mol。從能量角度看，F(xiàn)gCYP51B-F511L突變體與DIN之間的親和力要比FgCYP51B高，表明突變的位點(diǎn)可能有利于DIN的結(jié)合，進(jìn)一步導(dǎo)致烯唑醇對(duì)FgCYP51B-F511L突變體菌株的EC50值較野生型菌株要低。

從對(duì)接得到的結(jié)構(gòu)看，DIN結(jié)合在FgCYP51B活性口袋內(nèi)，參與二者結(jié)合的基本上為疏水性氨基酸殘基，主要有Tyr123、Phe131、Val136、Tyr137、Ala304、Met307、Ala308和Phe511，這些氨基酸殘基為受體結(jié)合DIN提供了一個(gè)極強(qiáng)的疏水性環(huán)境，有利于分子識(shí)別的順利進(jìn)行（圖6）。DIN在空間位置上靠近血紅素（HEME）的鐵，DIN中三氮唑上的N原子均可與血紅素中的Fe原子鰲合，可能會(huì)影響血紅素參與的酶促反應(yīng)過(guò)程。

將Phe511突變成Leu511后，DIN側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的朝向發(fā)生了變化，與Met307、Ala308和His311形成較強(qiáng)的疏水作用，有利于增強(qiáng)DIN與酶的親和力;同時(shí)由于Leu511的側(cè)鏈較Phe511更長(zhǎng)，通過(guò)烷基-烷基堆積作用誘導(dǎo)DIN的甲基發(fā)生扭轉(zhuǎn)，進(jìn)而與其形成較強(qiáng)的疏水作用（圖6）。由此導(dǎo)致FgCYP51B-F511L對(duì)DIN具有更強(qiáng)的親和力。

3 討論

在CYP51蛋白中主要有6個(gè)底物識(shí)別區(qū)域（SRS1～SRS6），其中SRS1和SRS4是最保守的。在目前的研究中，CYP51蛋白位點(diǎn)的突變主要集中在N端SRS1結(jié)合區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)重要氨基酸突變后能夠引起蛋白與殺菌劑的結(jié)合能力發(fā)生改變或者使蛋白的結(jié)構(gòu)及活性發(fā)生變化，從而引起抗性的產(chǎn)生[12，24-25]。如在綠糙棒菌Villosiclava virens、禾生球腔菌Mycosphaerella graminicola、禾谷鐮孢中，第137位酪氨酸突變后菌株對(duì)甾醇脫甲基抑制劑產(chǎn)生了抗性[12，26-27];而白色念珠菌Candida albicans中Tyr132、Phe145突變?cè)诮档痛呋钚缘耐瑫r(shí)也使得病原菌對(duì)殺菌劑產(chǎn)生了抗性[28]。前期課題組通過(guò)遺傳學(xué)及生物信息學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了禾谷鐮孢中甾醇14α-脫甲基酶FgCYP51B與底物甾醇脫甲基抑制劑結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮重要作用的氨基酸位點(diǎn)，其中N端的123、136、137位氨基酸均位于SRS1底物結(jié)合區(qū)域，而511位氨基酸位于SRS6底物結(jié)合區(qū)域[11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢第137位酪氨酸突變成組氨酸后對(duì)戊唑醇的敏感性降低[12]。此外，該位點(diǎn)的突變還會(huì)導(dǎo)致禾谷鐮孢產(chǎn)分生孢子的能力下降，而且會(huì)影響有性世代子囊孢子的發(fā)育[13]。

本研究對(duì)FgCYP51B第511位氨基酸突變（F511L）后菌株的分生孢子產(chǎn)量、菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率等生物學(xué)表型以及常用甾醇脫甲基抑制劑敏感性進(jìn)行了分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FgCYP51B的敲除導(dǎo)致禾谷鐮孢分生孢子產(chǎn)生降低，這與之前的報(bào)道一致[23]。蛋白質(zhì)中的重要氨基酸往往會(huì)直接或者間接影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，本研究中FgCYP51B-F511L突變體表型與FgCYP51B基因敲除體表型基本一致，表明F511確實(shí)在FgCYP51B發(fā)揮功能過(guò)程中起重要作用。分子對(duì)接表明F511L突變可以直接改變與烯唑醇分子的相互作用，從而參與病原菌對(duì)烯唑醇敏感性的變化。該位點(diǎn)的苯丙氨酸殘基在不同病原菌中是比較保守的，本研究中與禾谷鐮孢野生型菌株相比，F(xiàn)gCYP51B-F511L突變體對(duì)烯唑醇的敏感性升高，而等價(jià)的PdCYP51B-F506I突變和G459S突變共同導(dǎo)致指梗青霉對(duì)咪鮮胺敏感性的降低[15]，這表明該氨基酸殘基在CYP51蛋白家族與甾醇脫甲基酶抑制劑中發(fā)揮重要的作用，其突變可能會(huì)導(dǎo)致病原菌對(duì)DMIs藥劑敏感性的改變。通過(guò)對(duì)重要氨基酸位點(diǎn)突變后進(jìn)行表型分析，我們闡明了FgCYP51B與甾醇脫甲基抑制劑互作過(guò)程中重要氨基酸F511的功能，為其他氨基酸的功能研究以及其他真菌中相應(yīng)氨基酸表型的研究提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] GOSWAMI R S， KISTLER H C. Heading for disaster： Fusarium graminearum on cereal crops [J]. Molecular Plant Pathology， 2004， 5（6）： 515-525.

[2] DEAN R， VAN KAN J A L， PRETORIUS Z A， et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology [J]. Molecular Plant Pathology， 2012， 13（4）： 414-430.

[3] KANG Z， BUCHENAUER H. Studies on the infection process of Fusarium culmorum in wheat spikes： degradation of host cell wall components and localization of trichothecene toxins in infected tissue [J]. European Journal of Plant Pathology， 2002， 108（7）： 653-660.

[4] YIN Yanni， LIU Xin， LI Bin， et al. Characterization of sterol demethylation inhibitor-resistant isolates of Fusarium asiaticum and F.graminearum collected from wheat in China [J]. Phytopathology， 2009， 99（5）： 487-497.

[5] CHEN Changjun， YU Junjie， BI Chaowei， et al. Mutations in a β-tubulin confer resistance of Gibberella zeae to benzimidazole fungicides [J]. Phytopathology， 2009， 99（12）： 1403-1411.

[6] ZHENG Zhitian， HOU Yiping， CAI Yiqiang， et al. Whole-genome sequencing reveals that mutations in myosin-5 confer resistance to the fungicide phenamacril in Fusarium graminearum [J/OL]. Scientific Reports， 2015， 5（1）： 8248. DOI：10.1038/srep08248.

[7] ZHANG Chengqi， CHEN Yun， YIN Yanni， et al. A small molecule species specifically inhibits Fusarium myosin I [J]. Environmental Microbiology， 2015， 17（8）： 2735-2746.

[8] FAN Jieru， CHEN Fu， DIAO Yongzhao， et al. The Y123H substitution perturbs FvCYP51B function and confers prochloraz resistance in laboratory mutants of Fusarium verticillioides[J]. Plant Pathology， 2014， 63（4）： 952-960.

[9] DUDAKOVA A， SPIESS B， TANGWATTANACHULEEPORN M， et al. Molecular tools for the detection and deduction of azole antifungal drug resistance phenotypes in Aspergillus species [J]. Clinical Microbiology Reviews， 2017， 30（4）： 1065-1091.

[10]BECHER R， WIRSEL S G R. Fungal cytochrome P450 sterol 14α-demethylase （CYP51） and azole resistance in plant and human pathogens [J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2012， 95（4）： 825-840.

[11]QIAN Hengwei， DUAN Meilin， SUN Xiaomei， et al. The binding mechanism between azoles and FgCYP51B， sterol 14α-demethylase of Fusarium graminearum： Interaction between azoles and FgCYP51B [J]. Pest Management Science， 2018， 74（1）： 126-134.

[12]QIAN Hengwei， DU Juan， CHI Mengyu， et al. The Y137H mutation in the cytochrome P450 FgCYP51B protein confers reduced sensitivity to tebuconazole in Fusarium graminearum [J]. Pest Management Science， 2018， 74（6）： 1472-1477.

[13]遲夢(mèng)宇， 錢(qián)恒偉， 趙穎， 等. 禾谷鐮孢FgCYP51B蛋白Y137H影響分生孢子及子囊孢子發(fā)育[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2019， 49（2）： 283-288.

[14]ZHAO Yanxiang， CHI Mengyu， SUN Huilin， et al. The FgCYP51B Y123H mutation confers reduced sensitivity to prochloraz and is important for conidiation and ascospore development in Fusarium graminearum [J]. Phytopathology， 2021， 111（8）： 1420-1427.

[15]WANG Jinlong， YU Jinhui， LIU Jing， et al. Novel mutations in CYP51B from Penicillium digitatum involved in prochloraz resistance [J]. Journal of Microbiology， 2014， 52（9）： 762-770.

[16]LI Jinli， LIU Xiangyang， XIE Jiatao， et al. A comparison of different estimation methods for fungicide EC50 and EC95 values [J]. Journal of Phytopathology， 2015， 163（4）： 239-244.

[17]HARGROVE T Y， WAWRZAK Z， LAMB D C， et al. Structure-functional characterization of cytochrome P450 sterol 14α-demethylase （CYP51B） from Aspergillus fumigatus and molecular basis for the development of antifungal drugs [J]. Journal of Biological Chemistry， 2015， 290（39）： 23916-23934.

[18]WATERHOUSE A， BERTONI M， BIENERT S， et al. SWISS-MODEL： Homology modelling of protein structures and complexes [J]. Nucleic Acids Research， 2018， 46（W1）： W296-W303.

[19]LASKOWSKI R A， MACARTHUR M W， MOSS D S， et al. PROCHECK： a program to check the stereochemical quality of protein structures [J]. Journal of Applied Crystallography， 1993， 26（2）： 283-291.

[20]BENKERT P， BIASINI M， SCHWEDE T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models [J]. Bioinformatics， 2011， 27（3）： 343-350.

[21]MORRIS G M， HUEY R， LINDSTROM W， et al. AutoDock4 and AutoDockTools4： Automated docking with selective receptor flexibility [J]. Journal of Computational Chemistry， 2009， 30（16）： 2785-2791.

[22]MAIER J A， MARTINEZ C， KASAVAJHALA K， et al. ff14SB： Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB [J]. Journal of Chemical Theory and Computation， 2015， 11（8）： 3696-3713.

[23]FAN Jieru， URBAN M， PARKER J E， et al. Characterization of the sterol 14α-demethylases of Fusarium graminearum identifies a novel genus-specific CYP51 function [J]. New Phytologist， 2013， 198（3）： 821-835.

[24]LEROUX P， WALKER A S. Multiple mechanisms account for resistance to sterol 14α-demethylation inhibitors in field isolates of Mycosphaerella graminicola [J]. Pest Management Science， 2011， 67（1）： 44-59.

[25]PEREIRA D A， MCDONALD B A， BRUNNER P C. Mutations in the CYP51 gene reduce DMI sensitivity in Parastagonospora nodorum populations in Europe and China [J]. Pest Management Science， 2017， 73（7）： 1503-1510.

[26]WANG Fei， LIN Yang， YIN Weixiao， et al. The Y137H mutation of VvCYP51 gene confers the reduced sensitivity to tebuconazole in Villosiclava virens [J/OL]. Scientific Reports， 2015， 5（1）： 17575. DOI：10.1038/srep17575.

[27]COOLS H J， MULLINS J G L， FRAAIJE B A， et al. Impact of recently emerged sterol 14α-demethylase （CYP51） variants of Mycosphaerella graminicola on azole fungicide sensitivity [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2011， 77（11）： 3830-3837.

[28]KUDO M， OHI M， AOYAMA Y， et al. Effects of Y132H and F145L substitutions on the activity， azole resistance and spectral properties of Candida albicans sterol 14-demethylase P450 （CYP51）： A live example showing the selection of altered P450 through interaction with environmental compounds [J]. The Journal of Biochemistry， 2005， 137（5）： 625-632.

（責(zé)任編輯：楊明麗）