生存素抑制劑YM155對(duì)腦梗死大鼠微血管密度及血管新生相關(guān)基因表達(dá)的影響

黃建敏 云艷芳 楊桂新 陳海燕 蔣勇明 黃東旭 劉潔 莫曉榕 李雪斌

右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣西百色 533000）

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）具有高發(fā)病率、高致殘率和高病死率的特點(diǎn)，最近幾年已成為中國(guó)居民首位死亡原因，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，給人類健康帶來沉重的負(fù)擔(dān)［1］。在時(shí)間窗內(nèi)，即使采用靜脈、動(dòng)脈阿替普酶溶栓或血管內(nèi)機(jī)械血栓切除術(shù)等標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但是仍有很多患者預(yù)后不良［2］。造成這種預(yù)后不良的關(guān)鍵因素之一是側(cè)支循環(huán)代償能力不足。因此，深入研究腦側(cè)支循環(huán)發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制對(duì)改善AIS 患者預(yù)后具有重要現(xiàn)實(shí)意義。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VECs）不僅提供一個(gè)光滑細(xì)胞表面，還可分泌抗凝、抗血小板物質(zhì)和纖溶蛋白，防止血栓形成，同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)血管緊張度，抑制血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）遷移和增殖，抑制中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向血管壁黏附聚集，保護(hù)血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保證血管通暢起重要作用［3-6］。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)VECs 存在細(xì)胞活性低、生長(zhǎng)及更新速度慢、分裂增殖慢和細(xì)胞容易凋亡等自身缺陷［7］，極大程度限制其臨床應(yīng)用。生存素（Survivin）是由BIRC5 基因編碼，既能抑制細(xì)胞凋亡，又能調(diào)控細(xì)胞有絲分裂雙重功能的蛋白質(zhì)因子。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Survivin 具有增強(qiáng)細(xì)胞活力和遷移能力、減少凋亡和刺激新生血管生成等多重功能［8］。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VECs）內(nèi)的Survivin 缺乏可導(dǎo)致胚胎時(shí)血管生成、心臟發(fā)生和神經(jīng)管閉合等方面缺陷［9］?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠VECs BIRC5 基因過表達(dá)在體內(nèi)可促進(jìn)血管新生，有利于機(jī)體側(cè)支循環(huán)的建立［10］。MA 等［11］在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中研究發(fā)現(xiàn)，Survivin 通過激活NOTCH 通路促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、提高血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)和抑制細(xì)胞凋亡?？梢?，BIRC5 基因及其表達(dá)Survivin可以克服VECs 自身缺陷，促進(jìn)新生血管生成，在腦側(cè)支循環(huán)代償進(jìn)程中可能起重要的調(diào)控作用。內(nèi)皮抑素（endostatin，ES）及血小板反應(yīng)蛋白?1（thrombospondin?1，TSP?1）是兩種較強(qiáng)的內(nèi)源性血管新生抑制因子，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最有效的促血管生成因子，他們之間相互作用、相互影響參與新生血管的形成，改善組織供血［12-14］，提示這種血管新生抑制因子和促血管生成因子的相互作用可能是腦側(cè)支循環(huán)發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)通過建立腦缺血大鼠模型，采用Survivin 抑制劑YM155 進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)腦組織中微血管密度（microvessel density，MVD）和血管新生相關(guān)Survivin、VEGF、ES、TSP?1 基因及其蛋白表達(dá)的變化，探討Survivin、VEGF、ES、TSP?1 表達(dá)與血管新生的關(guān)系，為側(cè)支循環(huán)發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制以及AIS 側(cè)支循環(huán)治療新靶點(diǎn)的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 120 只健康SPF 級(jí)SD雄性大鼠購自江蘇艾凌菲生物科技公司（許可證號(hào)：SYXK（蘇）2019?0314），體質(zhì)量200 ～ 300 g，鼠齡10～12 周；尼龍線購自上海禾豐制藥有限公司；CD31 一抗（貨號(hào)：orb10314，濃度：1∶100）購自上海復(fù)申生物科技有限公司；DAB 試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰荆籧DNA 第一鏈合成試劑盒購自北京百奧萊博生物科技有限公司；Survivin（貨號(hào)：BK?K5040，濃度：1∶100）、VEGF（貨號(hào)：5363?100，濃度：1∶200）、ES（貨號(hào)：YM?x0547p，濃度：1∶300）、TSP?1（貨號(hào)：BK?K5541，濃度：1∶200）一抗購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；辣根過氧化物酶二抗購自上海李記生物科技有限公司；Survivin 抑制劑YM155 購自北京欣興唐生物科技有限公司；PCR儀、凝膠成像儀、BXM?950 光學(xué)顯微鏡及蛋白印跡設(shè)備購自美國(guó)Bio Rad 公司。

1.2 模型建立及分組處理 將120 只SD 雄性大鼠隨機(jī)分4 組（n= 30）：假手術(shù)組（Sham 組）、模型組（Model 組）、YM155 組（YM 組）和生理鹽水對(duì)照組（NS 組）。Model 組：參考文獻(xiàn)［15］以大腦中動(dòng)脈線栓法建立腦缺血模型，大鼠麻醉后，取0.285 mm直徑的尼龍線，將大腦中動(dòng)脈主干及其側(cè)支結(jié)扎阻斷血流2 h，制造MCA 局部缺血，在整個(gè)過程大腦前動(dòng)脈及大腦后動(dòng)脈血流完全沒有影響，隨后抽回尼龍線，大腦中動(dòng)脈血流恢復(fù)后，完成大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞造模。Sham 組不做血管結(jié)扎或阻塞，其余操作同Model 組。造模后第1 天開始，YM組大鼠按6.5 mg/kg 劑量的YM155 充入Alzet 滲透式膠囊泵中，無菌條件下于大鼠腹部皮下切一1 cm 左右的縱行小口，將該泵與切口垂直方向植入大鼠腹部皮下，縫合切口。NS 組按YM 組方法將等量生理鹽水植入大鼠腹部皮下。本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：YYFY?LL?2019?008。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 免疫組化法檢測(cè)MVD 根據(jù)文獻(xiàn)［16］，通過測(cè)定CD31 陽性細(xì)胞表達(dá)確定大鼠腦組織MVD。各組大鼠給予相應(yīng)處理后飼養(yǎng)2周，隨機(jī)選取10只大鼠行免疫組化檢測(cè)。方法：處死大鼠，取梗死側(cè)腦組織，40 g/L 多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm 厚切片，脫蠟后，以梯度酒精（高到低）依次浸泡處理，然后以蒸餾水漂洗，加入0.3% H2O2，室溫孵育30 min，加入5% 血清，室溫孵育2 h，加入CD31 一抗，4 ℃孵育過夜，TBS 漂洗3 次，采用大鼠二步法免疫組化試劑盒及DAB 試劑盒做免疫組化染色，操作步驟參照說明書，然后以蒸餾水漂洗、梯度酒精脫水（低到高）、透明后封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察半暗帶區(qū)并計(jì)數(shù)10 個(gè)高倍鏡視野（10×40）中的CD31 陽性細(xì)胞數(shù)，取均值即為該標(biāo)本每高倍鏡視野中的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.2 RT?PCR 檢測(cè)Survivin、VEGF、ES、TSP?1mRNA 的表達(dá) 各組大鼠給予相應(yīng)處理后飼養(yǎng)2 周，隨機(jī)選取10 只大鼠行RT?PCR 檢測(cè)。取50～100 mg 梗死側(cè)新鮮大腦組織經(jīng)研磨后加入1 mL核酸提取劑，按trizol 試劑盒說明書提取總RNA，使用微量分光光度儀檢測(cè)RNA 純度和濃度，要求D（λ）260/D（λ）280 比值在1.8～2.0 之間。根據(jù)cDNA 第一鏈合成試劑盒說明，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，用PCR 試劑盒檢測(cè)Survivin、VEGF、ES、TSP?1 mRNA的表達(dá)水平。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。以β?action 作為內(nèi)參照，引物序列：β?actin上游引物：5′?CCCATCTATGAGGGTTACGC?3′，下游 引 物：5′?TTTAATGTRCACGCAVGATTTC?3 ′；Survivin 上游引物：5′?TAAGCCACTTGTCCCAGCTT?3′，下游引物：5′?CTCATCCACTCCCTTCCTCA?3′；VEGF 上游引物：5′?TGCCCCTAATGCGGTGT?3′，下游引物：5′?TGCTGGCTTTGGTGAGGTT?3′；ES 上游引物：5′?：GCCCAATCAGCTTTCCATGT?3 ′，下游引物：5′?TGCATACCTGTGTGTTTGGC?3 ′；TSP?1 上游引物：5′?TGACCCTGGACTTGCTGTAG?3 ′，下游引物：5′?：CCAGCATAGTCGTCATCCCT?3 ′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 免疫印跡法檢測(cè)Survivin、VEGF、ES、TSP?1蛋白表達(dá) 各組大鼠給予相應(yīng)處理后飼養(yǎng)2 周，隨機(jī)選取10 只大鼠行免疫印跡檢測(cè)。取梗死側(cè)新鮮大腦組織，置于研缽中研碎，加入蛋白裂解液于冰浴中，采用勻漿機(jī)勻漿，取勻漿液，3 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清液，參照BCA 試劑盒說明，以其測(cè)定上清液中總蛋白濃度，根據(jù)結(jié)果調(diào)整各組蛋白濃度使之相同，煮沸變性后取20 μL 蛋白使用電泳儀SDS?PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，分別以Survivin、VEGF、ES、TSP?1 一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST 溶液漂洗3 次后，辣根過氧化物酶二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，TBST 再漂洗3 次，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，用Image master VDS 成像系統(tǒng)攝影，圖像分析軟件（Total lab V101）行灰度掃描分析。以目的蛋白與GAPDH 蛋白產(chǎn)物條帶灰度的比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YM155干預(yù)對(duì)MVD的影響 與Sham組比較，Model 組和NS 組CD31 免疫陽性MVD 顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與Model組比較，YM 組CD31 免疫陽性MVD 值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 4 組大鼠缺血腦組織CD31 免疫陽性MVD 比較Tab.1 Comparison of CD31 positive MVD in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

表1 4 組大鼠缺血腦組織CD31 免疫陽性MVD 比較Tab.1 Comparison of CD31 positive MVD in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

注：與Sham 組比較，*P ＜0.01；與Model 組比較，#P ＜0.01

組別Sham 組Model 組YM 組NS 組例數(shù)10 10 10 10 MVD 8.9±3.14 15.5±3.66*9.5±2.27#14.7±2.41*

圖1 免疫組化觀察4 組大鼠缺血腦組織CD31 免疫陽性細(xì)胞表達(dá)（×400）Fig.1 Expression of CD31 positive cells in ischemic brain tissue of rats among 4 groups was observed by immunohistochemistry（×400）

2.2 YM155 干預(yù)對(duì)Survivin、VEGF、ES、TSP?1 mRNA 表達(dá)的影響 本研究采用RT?PCR 法檢測(cè)缺血腦組織YM155 干預(yù)前后Survivin、VEGF、ES、TSP?1 mRNA 表達(dá)，結(jié)果顯示，與Sham 組比較，Model 組和NS 組Survivin、VEGF mRNA 表達(dá)顯著增加，而ES、TSP?1 mRNA 表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與Model 組比較，YM 組Survivin、VEGF mRNA 表達(dá)顯著降低，而ES、TSP?1 mRNA 表達(dá)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠缺血腦組織Survivin、VEGF、ES、TSP?1 mRNA 表達(dá)比較Tab.2 Comparison of survivin，VEGF，ES and TSP?1 mRNA expression in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

表2 各組大鼠缺血腦組織Survivin、VEGF、ES、TSP?1 mRNA 表達(dá)比較Tab.2 Comparison of survivin，VEGF，ES and TSP?1 mRNA expression in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

注：與Sham 組比較，*P ＜0.01；與Model 組比較，#P ＜0.01

組別Sham 組Model 組YM 組NS 組Survivin 1.09±0.07 1.18±0.04*0.63±0.04#1.20±0.04*VEGF 1.19±0.03 1.25±0.02*0.66±0.04#1.28±0.05*ES 1.00±0.04 0.89±0.06*1.56±0.06#0.86±0.04*TSP?1 1.01±0.05 0.88±0.02*1.52±0.04#0.90±0.03*

2.3 YM155 干預(yù)對(duì)Survivin、VEGF、ES、TSP?1蛋白表達(dá)的影響 本研究采用免疫印跡法檢測(cè)缺血腦組織YM155 干預(yù)前后Survivin、VEGF、ES、TSP?1 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與Sham 組比較，Model組與NS 組Survivin、VEGF 蛋白表達(dá)顯著增加，而ES、TSP?1 蛋白表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與Model 組比較，YM 組Survivin、VEGF 蛋白表達(dá)顯著降低，而ES、TSP?1 蛋白表達(dá)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3和圖2。

表3 各組大鼠缺血腦組織Survivin、VEGF、ES、TSP?1蛋白表達(dá)比較Tab.3 Comparison of survivin，VEGF，ES and TSP?1 protein expression in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

表3 各組大鼠缺血腦組織Survivin、VEGF、ES、TSP?1蛋白表達(dá)比較Tab.3 Comparison of survivin，VEGF，ES and TSP?1 protein expression in ischemic brain tissue of rats among 4 groups ±s

注：與Sham 組比較，*P ＜0.01；與Model 組比較，#P ＜0.01

組別Sham 組Model 組YM 組NS 組Survivin 2.72±0.14 2.87±0.18*1.54±0.10#2.85±0.13*VEGF 2.54±0.02 2.72±0.03*1.59±0.03#2.73±0.02*ES 1.03±0.14 0.88±0.03*1.60±0.26#0.85±0.03*TSP?1 1.03±0.03 0.85±0.02*1.58±0.03#0.83±0.03*

圖2 免疫印跡法觀察4 組大鼠缺血腦組織Survivin、VEGF、ES、TSP?1 蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of survivin,VEGF,ES and TSP?1 protein in ischemic brain tissue of rats among 4 groups were observed by Western blot

3 討論

腦側(cè)支循環(huán)是在顱內(nèi)動(dòng)脈發(fā)生嚴(yán)重狹窄或閉塞時(shí)起代償作用的內(nèi)源性吻合通路，可將血液供應(yīng)重新定向到缺血區(qū)，以維持血流灌注并可挽救缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞功能，對(duì)腦梗塞患者預(yù)后具有重要的臨床意義［17-18］。臨床資料顯示，良好側(cè)支循環(huán)能夠縮小AIS 梗死灶體積、延長(zhǎng)治療時(shí)間窗、提高患者治療獲益［19-20］。腦側(cè)支循環(huán)分三級(jí)，一級(jí)側(cè)支循環(huán)為Willis 環(huán)，二級(jí)側(cè)支循環(huán)為顱內(nèi)?顱外血管吻合支和顱內(nèi)動(dòng)脈吻合支，三級(jí)側(cè)支循環(huán)是新生血管，當(dāng)一級(jí)、二級(jí)側(cè)支循環(huán)供血不良時(shí)，成為挽救缺血腦細(xì)胞死亡的最后環(huán)節(jié)，是目前臨床研究腦側(cè)支循環(huán)的熱點(diǎn)。因此，深入研究腦側(cè)支循環(huán)發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制對(duì)AIS 患者創(chuàng)新性治療手段、改善預(yù)后具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

VECs 是構(gòu)成血管壁重要細(xì)胞，在促進(jìn)新生血管生成、維持側(cè)支循環(huán)內(nèi)膜穩(wěn)定性、保證管腔長(zhǎng)期通暢等方面起重要的調(diào)控作用［21-22］。然而，成熟VECs 活性低、生長(zhǎng)緩慢、更新速度慢等缺陷限制了其功能發(fā)揮。Survivin 是凋亡抑制蛋白家族中分子量最小抗凋亡作用最強(qiáng)的蛋白分子。研究表明，其通過抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂和使細(xì)胞適應(yīng)不利環(huán)境來保護(hù)細(xì)胞，促進(jìn)新生血管生成［8］。動(dòng)物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，BIRC5 基因轉(zhuǎn)染VECs后可以減少G1/M 期細(xì)胞合成，增加G2/M 期細(xì)胞含量，調(diào)控G1/S 蛋白，促進(jìn)微血管生成，有助于機(jī)體側(cè)支循環(huán)的建立［10］。在小鼠模型中，將BIRC5基因轉(zhuǎn)染主動(dòng)脈VECs 并培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白、Survivin mRNA 及其蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖顯著增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞侵襲性和遷移活性顯著增強(qiáng)［23］。這些研究結(jié)果顯示BIRC5 基因及其表達(dá)Survivin 可以克服VECs 自身缺陷，促進(jìn)新生血管生成，提示這一途徑在側(cè)支循環(huán)新生血管生成、內(nèi)膜穩(wěn)定性以及管腔血流通暢中可能起重要調(diào)節(jié)作用。

梗死后微血管新生是決定缺血性神經(jīng)元存活的關(guān)鍵因素，對(duì)促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)、改善預(yù)后具有重要意義。在血管新生研究中，MVD 是普遍采用的能夠直觀和有效反映新生血管的數(shù)目和側(cè)支循環(huán)建立的指標(biāo)。CD31 是表達(dá)于VECs 間緊密連接處的一種血小板?VECs 黏附分子，參與介導(dǎo)血管生成，可反映MVD 大小，因此可作為檢測(cè)MVD 的標(biāo)記物［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面發(fā)現(xiàn)，Model 組和NS組的Survivn 和MVD 比Sham 組顯著增加，顯示腦梗塞急性期新生血管生成增多，其機(jī)制可能是腦梗塞急性期微血管新生自我保護(hù)的結(jié)果，這與國(guó)外學(xué)者GREGORIUS 等［24］報(bào)道相類似；另一方面發(fā)現(xiàn)，YM 組Survivin 和MVD 明顯低于Model 組，表明Survivin 抑制劑YM155 可以抑制腦梗死后的微血管新生，使新生血管生成減少，導(dǎo)致MVD 下降，因此，本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物體內(nèi)證實(shí)Survivin 參與新生血管生成。

VEGF 是具有促血管新生作用的細(xì)胞因子，能夠增加腦卒中病灶內(nèi)側(cè)支循環(huán)的數(shù)目并為神經(jīng)功能修復(fù)提供所需的養(yǎng)分，在微血管形成的中間環(huán)節(jié)具有重要調(diào)控作用。ES 是目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管新生抑制因子，腦缺血損傷后主要表達(dá)于海馬、側(cè)腦室周圍、紋狀體等區(qū)域。目前已廣泛證實(shí)ES 可特異性作用于VECs，抑制VECs 增殖和遷移及誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，在抑制血管生成方面發(fā)揮著重要作用，其機(jī)制大致表現(xiàn)為ES 下調(diào)VEGF 表達(dá)，競(jìng)爭(zhēng)性阻斷VEGF 信號(hào)傳遞并減少VEGF 受體數(shù)量和生物學(xué)活性，從而發(fā)揮抑制腦VECs 增殖作用［25］。TSP?1 可以抑制VEGF 下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)VEGF 受體2 加速降解，抑制VEGF 受體2 和eNOS磷酸化作用，導(dǎo)致血管新生受到阻礙；其次，抑制VEGF、bFGF 與其受體的結(jié)合，從而抑制VECs 增生［26］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，促血管生成因子Survivin、VEGF mRNA 及其蛋白表達(dá)水平在Model 組和NS組顯著高于Sham 組，而在YM 組中表達(dá)明顯低于Model 組，與MVD 高表達(dá)呈現(xiàn)一致結(jié)果；血管新生抑制因子ES、TSP?1mRNA 及其蛋白表達(dá)水平在Model 組均低于Sham 組，而在YM 組中表達(dá)明顯高于Model 組，與MVD 高表達(dá)呈現(xiàn)相反的結(jié)果，提示新生血管生成與促血管生成因子Survivin、VEGF上調(diào)和新生血管抑制因子ES、TSP?1 下調(diào)有關(guān)，它們之間可能存在密切的相互作用、相互影響，參與腦側(cè)支循環(huán)建立和形成。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin 抑制劑YM155 可以下調(diào)Survivin、VEGF 表達(dá)和上調(diào)ES、TSP?1 表達(dá)，進(jìn)而降低MVD，提示這些因子之間相互作用、相互影響可能是腦側(cè)支循環(huán)建立和形成的重要機(jī)制之一。但是本研究還具有一定的局限性，僅僅從負(fù)性調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究以及觀察某個(gè)特定時(shí)間點(diǎn)的變化，對(duì)于正性調(diào)控機(jī)制和時(shí)空模式變化規(guī)律需要進(jìn)一步深入研究。