糞便miRNA作為結直腸癌生物標記物的價值

曾家興 田菁菁 盧偉 黃銳 陳俊豪張林 謝雪晴 張媛玲 丁杰

1貴州省人民醫(yī)院普外科（貴陽 550000）；2貴州醫(yī)科大學（貴陽 550000）；3貴州大學醫(yī)學院（貴陽 550000）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）在臨床上占消化系統(tǒng)惡性腫瘤之首，據(jù)2020年GLOBOCAN 統(tǒng)計報告表明，CRC 是全球第三大常見癌癥，也是癌癥死亡的第二大原因［1］。雖然90%的早期診斷患者總存活率超過5年，但在遠處轉(zhuǎn)移的患者中，這一數(shù)字不到10%［2］。然而，CRC 通常在早期階段沒有癥狀，并在人群中零星出現(xiàn)，對有效和及時的治療構成了挑戰(zhàn)。因此，利用一種非侵入性方法對無癥狀個體進行大規(guī)模篩查是一項公共衛(wèi)生高度的優(yōu)先事項。

1 結直腸癌的篩查方式

目前篩查CRC 的常見方法有糞便隱血試驗（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）、糞便免疫化學檢測（fecal immunochemical test，F(xiàn)IT）以及腸鏡等。FOBT是最廣泛的CRC 篩查方法，成本低廉且無創(chuàng)，但易被飲食等其他因素干擾，易出現(xiàn)假陽性。FIT 和FOBT 類似，是利用針對人類珠蛋白抗體檢測糞便中的血紅蛋白，不受進食影響，與FOBT 相比，CRC篩查的參與度和CRC 的診斷率更高［3］，但抗體在轉(zhuǎn)運和儲存過程中易降解，且由于間歇性出血以及糞便中血紅蛋白的降解，導致約一半的CRC 和大多數(shù)息肉沒有被發(fā)現(xiàn)。腸鏡檢查是診斷CRC 最直接準確的方法，且病理結果是診斷CRC 和評估TNM 分期的金標準，由于需要腸道準備、飲食限制且存在侵入性、成本高和嚴重并發(fā)癥（如腸出血和腸穿孔等），導致患者的依從性低且難以作為CRC的常規(guī)篩查。另外如CT、MRI、鋇劑灌腸、腔內(nèi)超聲、腫瘤標記物（CEA、CA199）和糞便DNA 等檢查，同樣具有侵入性、費用昂貴、依從性低、敏感性和特異性低等問題。因此，目前迫切需要一種成本效益高的非侵入性CRC 篩查方法來最大限度地提高檢測準確率。

2 糞便miRNA 與結直腸癌的相關性

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類單鏈內(nèi)源性非編碼小分子RNA，約由22 個核苷酸組成，來源于發(fā)卡結構，廣泛存在于動物、植物和一些病毒中，超過60%的蛋白編碼基因由miRNA 調(diào)控，它在轉(zhuǎn)錄后水平負向調(diào)節(jié)基因表達［4］。成熟的miRNA 與AGO 蛋白（argonaute proteins）絡合成RNA 誘導沉默復合體（RNA?induced silencing com?plex，RISC），再通過引導AGO 蛋白和相關因子到mRNA 的3′端非翻譯區(qū)（untranslated region，3′UTR）的靶位點，活性miRNA 種子區(qū)與靶mRNA 的3′UTR完全堿基配對導致mRNA 斷裂降解；而部分堿基配對抑制了翻譯的起始或延伸階段［5］。單個miR?NA 可以調(diào)控多個靶基因，幾個miRNA 組合也可以精細調(diào)控某個基因的表達［4］。根據(jù)miRNA 在腫瘤中的功能和地位，一般將miRNA 分為促腫瘤miR?NA（oncomiR）和腫瘤抑制miRNA（tumor suppressor miRNA，tsmiR），oncomiR 抑制編碼腫瘤抑制蛋白的mRNA 來促進腫瘤，通常在腫瘤中表達上調(diào)，相反，tsmiR 在腫瘤中表達降低，因此它們靶向的致瘤mRNA 過度表達，特定的miRNA 具有雙重作用，可以同時產(chǎn)生競爭的致瘤和抑瘤效應［6］。

miRNA 的失調(diào)與CRC 的發(fā)生發(fā)展密切相關，它們通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號網(wǎng)絡，誘導細胞增殖，產(chǎn)生對細胞凋亡和化療的抵抗力，并促進轉(zhuǎn)移［7］。miRNA 的異常表達可能涉及結腸癌變的各個環(huán)節(jié)，在癌組織［8］、血液［9-10］和糞便［11］中分離出這些miRNA 可認為是CRC 早期診斷和預后評估的潛在生物標志物，并且可以通過調(diào)控oncomiR 或tsmiR的功能等干預措施來抑制腫瘤。不同研究表明，在CRC 中可使用低表達的tsmiR 的模擬物進行miRNA 的替代療法，如抑制細胞生長、遷移、侵襲和增加化療及藥物的敏感性；另一種反義治療，在CRC 中利用干擾RNA 來阻斷高表達的oncomiR 也有同樣的效果［12］，這表明miRNA 靶向治療有望成為一種新的CRC 治療手段。

miRNA 在進化上高度保守，不容易降解，能順利進入糞便并長期滯留，發(fā)揮調(diào)控作用，已經(jīng)證明miRNA 在72 h 的孵育期內(nèi)仍然可以在樣品中檢測到［13］。目前已在CRC 患者糞便中發(fā)現(xiàn)多種miRNA存在異常表達，異常的糞便miRNA 可能起源于脫落的惡性結直腸細胞，或由外泌體釋放進入糞便［14］，更能直接地反映腸腔病變的生物學變化。糞便miRNA 的穩(wěn)定性取決于它們的來源，因為結直腸細胞中的miRNA 和外泌體比游離miRNA 更能抵抗RNase 的降解［15］。而利用外周血液miRNA進行CRC 篩查的主要缺點是檢測特異性不高［16］，因為血液中miRNA 可能來自其他腫瘤［17］、精神分裂癥［18］和病毒感染［19］等。與外周血液檢測相比，糞便miRNA 可以更早地檢測到腫瘤細胞和大多數(shù)腫瘤標志物，具有更高的特異性、靈敏性和重復性［20］，且經(jīng)濟、無創(chuàng)。因此，糞便miRNA 可作為早期臨床診斷及預后的新型CRC 生物標志物。

3 糞便來源的miRNA 檢測方法及優(yōu)缺點

糞便miRNA 生物標志物檢測方法種類繁多，目前最主要的是RT?qPCR（reverse transcription quantitative?polymerase chain reaction，逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈式反應）、微陣列法及RNA 測序技術等。其中RT?qPCR 是最常用且最廣泛使用的檢測技術，被認為是miRNA 檢測的金標準，它可用于絕對和相對miRNA 定量，也可用于RNA 印跡法和微陣列進一步驗證，但miRNA 長度短，反轉(zhuǎn)錄步驟的設計相對復雜，易受到引物或探針干擾等缺點。微陣列法是基于miRNA 與探針的雜交反應，它可以同時檢測多個樣本，并且能夠檢測單個樣本的數(shù)百個靶序列，適用于高通量篩選和檢測，但檢測的范圍受限于探針的信息，只能檢測已知序列，而且靈敏度較差，芯片昂貴。RNA 測序技術能夠鑒別miRNA 和發(fā)現(xiàn)未知miRNA，能夠為miRNA 的發(fā)生及功能機制提供大量信息，且可以邊合成邊測序，耗時短，但儀器昂貴且需要專業(yè)的數(shù)據(jù)分析。

總之，糞便miRNA 不同檢測方法各有優(yōu)缺點，研究者需要根據(jù)miRNA 數(shù)量及信息來選擇合適的檢測方法，達到快速、高靈敏性特異性及高通量等目的，從而效率最大化。

4 糞便miRNA標志物在結直腸癌中的應用

4.1 糞便中單基因oncomiR 檢測 oncomiR 通過靶向編碼腫瘤抑制蛋白的mRNA 表現(xiàn)出促癌特性，這些miRNA 在CRC 患者糞便中上調(diào)。目前研究較為深入的是miR?21，它在CRC 中過度表達，能下調(diào)抑癌基因的表達，從而發(fā)揮促癌特性。BASTA?MINEJAD 等［21］采用RT?qPCR 檢測40 例CRC 患者及40 名健康對照者的糞便，發(fā)現(xiàn)CRC 患者糞便的miR?21 表達水平較對照組顯著上調(diào)10 倍，敏感性和特異性分別為86.05%、81.08%，AUC（area under the receiver operating characteristic curve，接受者操作特征曲線下面積）為0.829，能夠區(qū)分CRC 患者和健康者；且指出糞便miR?21 表達水平差異可顯著區(qū)分Ⅲ?Ⅳ期和Ⅰ?Ⅱ期（TNM 分期）CRC，其敏感性和特異性分別為88.1%和81.6%（AUC：0.872）。

LI 等［22］對77 例CRC 患者和29 例對照者的血清和糞便標本檢測miRNA，結果表明在CRC 患者中血清和糞便miR?135b?5p 表達均顯著上調(diào)，在區(qū)分CRC 患者及健康者上，糞便miR?135b?5p 的特異性為74.1%，敏感性為96.5%；在區(qū)別Ⅰ?Ⅱ期和Ⅲ?Ⅳ期（TNM 分期），特異性和敏感性分別為89.4%和80.9%，AUC 為0.92；而在鑒別Ⅰ?Ⅲ期和Ⅳ期，AUC 為0.78，且表明糞便miR?135b?5p 在區(qū)分CRC不同TNM 分期的診斷價值優(yōu)于其血清水平，可作為非侵入性生物標志物用于診斷Ⅲ?Ⅳ期CRC患者。

另一研究在79 例健康受試者和58 例CRC 患者的137 份糞便樣本進行了小RNA 測序，與健康對照相比，CRC 患者的糞便中miR?486?5p 表達明顯上調(diào)，且證實了miR?486?5p 在早期患者與健康對照組，以及晚期與非轉(zhuǎn)移性腫瘤的差異表達［23］，這說明了miR?486?5p 可作為CRC 診斷的特異性標志物。

4.2 糞便中單基因tsmiR 檢測 除了oncomiR，一些miRNA 可作為抑癌基因被稱為tsmiR，具有抑制腫瘤活性和抑制轉(zhuǎn)移的特性，它們在CRC 患者糞便中經(jīng)常下調(diào)。例如，AHMED 等［24］使用miRNA基因芯片對15 名個體的糞便樣本進行了全局微陣列表達研究，對其中20 個選定的miRNA 進行后續(xù)的qPCR 分析研究，在60 例患者的糞便中，發(fā)現(xiàn)8 個miRNA 表達下調(diào)（miR?9、miR?29b、miR?127?5p、miR?138、miR?143、miR?146a、miR?222 和miR?938），且隨著TNM 分期從早期到晚期進展，這種下調(diào)趨勢更加明顯。

ZHU 等［25］對80 例CRC 患者和51 例健康志愿者進行回顧性分析，檢測參與者糞便樣本中4 個miRNA（miR?29a，miR?145，miR?223 和miR?224）的水平，結果顯示CRC 患者糞便的miR?29a、miR?223和miR?224 水平明顯低于正常對照的糞便，且直腸癌患者糞便中的miR?29a 水平明顯高于近端和遠端結腸癌患者，而miR?223 和miR?224 與腫瘤位置無關，miR?29a，miR?223 和miR?224 的AUC 分別為0.777、0.649 和0.745，其敏感性和特異性分別為85%和61%、60%和71%、75%和63%。

與oncomiR 類似，CRC 患者糞便中tsmiR 表達降低，同樣具有相當可觀的敏感性和特異性，從而達到CRC 篩查和早期診斷的目的。

4.3 糞便中miRNA 多基因及多樣本聯(lián)合檢測 CHOI 等［26］報道CRC 糞便中miR?21、miR?92a、miR?144*和miR?17?3p 的表達水平顯著高于健康對照組，這4 種miRNA 檢測CRC 的敏感性均在70%以上，多變量分析顯示miR?92a和miR?144*與CRC顯著相關，miR?92a的敏感性為89.7%，特異性為51.7%，AUC 為0.76，而miR?144*分別為78.6%、66.7%、0.77，miR?92a 和miR?144*聯(lián)合檢測的敏感性為96.6%，比單獨運用FIT（73.8%）檢測CRC 更好。

一項薈萃分析［13］對46 篇關于CRC 研究和10項關于腺瘤研究，對應CRC、腺瘤患者和健康個體的6 475、783和5 569項糞便miRNA檢測，得出診斷CRC 最可靠的單個miRNA 是miR?21，AUC 為0.843，敏感性為59.3%，特異性為85.6%，miR?92a對應的值分別為0.794、46.8%、90.5%；而miR?21與miR?92a聯(lián)合對應的值分別為0.837、53.7%、87.8%。另外顯示晚期CRC 診斷準確率更高，遠端CRC 敏感性高于近端，因此糞便miR?21、miR?92a 及其聯(lián)合檢測可作為基于糞便CRC 篩查有前景的無創(chuàng)性標志物。

大多數(shù)研究側(cè)重于對單個樣本類型（例如血清、血漿或糞便）發(fā)現(xiàn)新的標志物，極少有研究系統(tǒng)性評估同一個體不同樣本類型的miRNA 在CRC 中的作用。CHANG等［27］選擇46個最常報告的CRC相關的miRNA 進行檢測，在檢測互補效應后，聯(lián)合分析糞便和血漿標本中常見的miR?223 和miR?92a，對CRC 的靈敏度最高，為96.8%，優(yōu)于FOBT（70%～75%）或多靶點糞便DNA 檢測（92.3%），特異性為75%，AUC 為0.907。且它們發(fā)現(xiàn)早期疾病或腫瘤體積較小的CRC 患者的結果與晚期疾病或腫瘤體積較大的患者相當。

因此，在兩種類型的CRC 臨床樣本中建立miRNA 生物印記，可以用于大腸癌的早期檢測，且多個miRNA 聯(lián)合的互補作用顯示出良好的敏感性和相當?shù)奶禺愋?，能提高CRC 的檢出率。

4.4 糞便miRNA 聯(lián)合其他生物標志物檢測 LI?ANG 等［28］收集381 例CRC 患者糞便樣本，建立了一種結合miR?92a、miR?21、miR?135b、miR?145 和miR?133a 5 個miRNA 的評分算法（C?index）。通過分析CRC 全基因組miRNA 表達譜，得出在單個miRNA 中，糞便miR?92a 區(qū)分CRC 患者與健康者表現(xiàn)最好，AUC 為0.782，敏感度與特異度均為72%，而C?index 較單個miRNA 相比，CRC 診斷性能顯著提高，AUC 為0.849，在特異性為80%時，敏感性為81%，而結合FIT 敏感性可提高到90%。對于晚期腺瘤（AA，advanced adenomas），特異性為80%時，C?index 的敏感性（33%）明顯高于FIT（17%），結合FIT 后進一步提高到43%。

DURAN?SANCHON 等［29］發(fā) 現(xiàn)miR?130b?3p、miR?21?5p、miR?221?5p、miR?25?3p、miR?27a?3p、miR?34a?5p 和miR421 這7 個miRNA 在CRC 患者糞便中顯著上調(diào)，miR?130b?3p、miR?21?5p、miR?27a?3p、miR?421 以及miR?335?3p 在AA 患者糞便中的表達顯著上調(diào)。在作者預測模型中miR?421、miR?27a?3p 和血紅蛋白組合識別CRC 患者的AUC 為0.93，而單獨檢測糞便血紅蛋白濃度的AUC 為0.67。聯(lián)合標記物識別AA 患者的AUC 為0.64，而單獨檢測糞便血紅蛋白的AUC 值為0.59?？傊S便中miRNA 和血紅蛋白水平組合比單獨檢測糞便中的血紅蛋白濃度更能準確地識別AA 或CRC患者。該作者的另一項研究［30］基于miR?421、miR?27a?3p 和糞便血紅蛋白濃度，以及年齡和性別的一種miRFec 的算法，該算法可以將CRC 患者與非晚期腺瘤或結腸鏡檢查正常的患者區(qū)分開來，AUC 為90%，避免了34%的結腸鏡檢查。該算法有助于FIT 陽性的部分群體，基于出現(xiàn)CRC 的概率非常低，可以避免結腸鏡檢查，提高CRC 篩查的成本和效率。

總之，糞便的miRNA 對腺瘤和CRC 非侵入性檢測有著較高的準確性，并且檢測一組miRNA 可能會使CRC 檢出率更高，而miRNA 與FOBT 或FIT的聯(lián)合可能會進一步提高檢測的準確性。

4.5 糞便miRNA 與結直腸癌手術的相關性 研究表明，對CRC 患者在根治性手術前后的糞便樣本中的miRNA 進行檢測，證實糞便miRNA 可以作為有用的動態(tài)標記物來監(jiān)測治療后的疾病研究。ROTELLI 等［31］通過RT?qPCR 篩查結腸鏡陰性CRC 患者及健康受試者的糞便，術前5 種miRNA（miR19b?3p，miR20a?5p，miR21?3p，miR 92a?3p，和miR141）的表達水平明顯高于對照組，而在根治性手術后顯著降低，其中miR20a?5p，miR21?3p和miR141 水平降低到與正常對照組相當?shù)闹怠?/p>

由上可見，一組特異性的糞便miRNA 在手術前過度表達，并在腫瘤切除后恢復到正常范圍，有望成為一種新的可靠的大腸癌二級預防工具。然而，此類試驗需要在大型前瞻性研究中加以探索，并與現(xiàn)有的篩查工具進行比較，評估少數(shù)糞便miRNAs 的可靠性。

4.6 糞便miRNA 與結直腸腺瘤等癌前病變的相關性 結直腸腺瘤是CRC 的主要癌前病變，尤其是晚期腺瘤，大部分CRC 都是由結直腸腺瘤演變而來。因此，通過檢測某些miRNA 來區(qū)分健康者與腺瘤、CRC 患者，可以為CRC 的早期篩查及診斷提供了新的思路。

ZHAO等［32］證實糞便中miR?194的表達從20例健康者、20 例腺瘤患者、28 例CRC 患者逐漸降低，提示miR?194 表達下調(diào)可能是大腸癌發(fā)生的早期事件，且糞便miR?194 的表達可以區(qū)分正常人和CRC 患者其AUC 為0.739，敏感性為60%，特異性為88.1%。因此糞便miR?194 有可能取代組織標本成為腺瘤及CRC 患者一種重要的早期診斷標志物。另外，LIU 等［33］檢測CRC、腺瘤和健康志愿者糞便標本的miR?21 和miR?146a 表達，結果表明與健康對照組比，糞便miR?21 水平在CRC 和腺瘤患者均顯著上調(diào)，而糞便miR?146a 僅在CRC 患者中明顯降低，腺瘤患者與健康對照組的miR?146a 表達差異無統(tǒng)計學意義，糞便miR?21、miR?146a 及其聯(lián)合表達水平均能顯著將CRC 患者（AUC 分別為0.877、0.794、0.878）、腺瘤患者（AUC 分別為0.877、0.794、0.878）與正常對照組區(qū)分開來；在區(qū)分CRC和腺瘤患者時，其AUC 值分別為0.699、0.815 和0.729。證實糞便標本中miRNA?21 和miRNA?146a對大腸癌的早期診斷具有潛在的應用價值。

5 展望

不少研究使用一組或多組糞便miRNA 作為生物標志物已具有較高的CRC 及癌前病變的檢出率，然而，糞便miRNA 需要依賴于定量檢測，并不能消除腸道微生物蛋白、DNA 和RNA 的潛在污染，而糞便miRNA 結合FIT 是提高檢測準確性的可靠方法。另外一個值得考慮的問題是如果樣本存在潛血，血細胞的miRNA 會干擾結果，使用FOBT/FIT 陽性和陰性樣本比較的對照研究可以解決，更全面的方法是使用miRNA 分析和比較匹配的血液、糞便和腫瘤組織，它能提供miRNA 水平變化來源的信息。

總之，糞便是一種非常適合CRC 篩查的介質(zhì)，糞便miRNA 對CRC 的診斷、預后和個性化治療具有重要的臨床意義，目前其檢測技術發(fā)展迅速，具有廣闊的應用前景，與CRC 進展相關的糞便miR?NA 水平定量變化，比當前臨床可用的檢測方法提供了更敏感更特異的非侵入性診斷標記。但仍需要大型的、理想多中心、雙盲隨機對照試驗，來確定糞便miRNA 在普通人群中作為CRC 生物標志物的價值。