負壓創(chuàng)面治療聯(lián)合脂肪干細胞在慢性創(chuàng)面治療中的研究進展

朱博恒 張璟琳 汪虹

昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院燒傷科（昆明 650188）

慢性創(chuàng)面一直是困擾外科醫(yī)生的一大難題，因為其發(fā)病機制復雜、具體誘因多樣、治療難度大，同時對患者的身心健康及生活質量等都產生了嚴重影響，增加患者的醫(yī)療費用，嚴重時甚至對患者產生生命威脅，給患者家庭和社會造成嚴重負擔，全球各地的醫(yī)生針對慢性創(chuàng)面也在不斷探尋著新的治療方法。近年來，隨著醫(yī)療科技的不斷發(fā)展，已有多種干細胞用于治療慢性創(chuàng)面，包括臍帶干細胞、骨髓干細胞、脂肪干細胞等，并且取得了不錯的療效。脂肪干細胞（adipose?derived stem cells，ADSCs）是機體存在的一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，其具有來源豐富、損傷小、獲得量大、增殖能力強且免疫原性低等獨特優(yōu)勢，被認為是組織工程理想的種子細胞之一［1］。負壓創(chuàng)面治療（negative pressure wound therapy，NPWT）起源于20 世紀90年代，又稱負壓輔助創(chuàng)面愈合技術或負壓封閉引流技術，廣泛用于創(chuàng)傷、燒傷、骨折、感染、外科手術、糖尿病足等所引起的急慢性創(chuàng)面的治療［2］。目前，已經有研究者將ADSCs 和NPWT 聯(lián)合應用治療慢性創(chuàng)面，取得了不錯的臨床效果，為慢性創(chuàng)面的治療提出了新思路。

1 慢性創(chuàng)面的定義

慢性創(chuàng)面又稱為難愈合性創(chuàng)面，是指通過正常、有序和及時的修復過程，無法達到解剖和功能完整的創(chuàng)面。在臨床上，慢性創(chuàng)面大多是指由于各種原因形成的創(chuàng)面，經過一個月以上的治療后未能愈合且無愈合傾向者［3］。慢性創(chuàng)面包含感染性創(chuàng)面、術后創(chuàng)面、糖尿病潰瘍創(chuàng)面、壓瘡等，具有病程長、并發(fā)癥多、對外觀影響大等特點，其修復難點在于創(chuàng)面的細胞因子（表皮生長因子、血管生成因子等）分泌不足、局部血液供應不足和細胞外基質合成不足等，同時還伴有炎癥反應持續(xù)存在，進而導致皮膚細胞功能受損、衰老、修復性干細胞減少以及無法再上皮化和創(chuàng)面修復［4］。目前在臨床上對于慢性創(chuàng)面的治療方法主要有外科清創(chuàng)、敷料覆蓋、負壓創(chuàng)面治療、植皮術或皮瓣轉移術，但創(chuàng)面總體愈合率較低。近年來也有一些新的治療方法出現(xiàn)，如干細胞移植、富血小板血漿治療、基因治療等。

2 ADSCs 促進創(chuàng)面愈合的機制

ADSCs 是一種從脂肪組織中分離提取得到的間充質干細胞，具有很強的自我更新能力、多向分化潛能和旁分泌功能。ADSCs 主要通過5 個方面來促進創(chuàng)面愈合：（1）調節(jié)炎癥反應：巨噬細胞作為傷口愈合過程中炎癥后期的一部分有兩種表型，其中M1 樣細胞主要表現(xiàn)為早期促進炎癥反應、吞噬病原體和受損細胞；而M2 樣細胞主要表現(xiàn)為晚期抗炎反應、促進組織重塑和血管生成。ADSCs 可以通過反式激活精氨酸酶?1 誘導抗炎M2 表型、免疫調節(jié)抑制巨噬細胞活化、誘導巨噬細胞凋亡等來促進炎癥反應減輕，達到了抑制炎癥的效果［5-6］。（2）促進血管生成：ADSCs 可分泌大量生長因子，如VEGF、BFGF、HGF、IGF?Ⅰ等，這些細胞因子均可以促進血管生成。并且ADSCs 還可以通過外泌體中hsa?miR?760 的顯著上調和hsa?miR?423?3p 的顯著下調可以調節(jié)ITGA5 和HDAC5基因的表達，從而達到促血管化的目的［7］。（3）調節(jié)細胞外基質：ADSCs 可以誘導形成細胞外基質，并分泌大量糖原、黏多糖、蛋白多糖、糖蛋白、和膠原纖維等，從而加強細胞和細胞外基質之間的相互作用［8］。（4）調控成纖維細胞活動：ADSCs 還可以作用于細胞間的信號傳導和旁分泌功能等來促進成纖維細胞遷移、增殖和分泌，從而合成大量的膠原纖維、基質成分和肉芽組織等，填補創(chuàng)面組織缺損［9］。（5）促進上皮化：ADSCs 通過增加轉化生長因子?β1 和纖連蛋白的表達，進而誘導上皮組織再生［10］。因此ADSCs 通過調控炎癥反應及細胞外基質的合成、調控纖維細胞的活動、促進血管再生及上皮組織再生來促進創(chuàng)面愈合，但是根據(jù)目前大量的研究表明ADSCs 在治療創(chuàng)面的過程中仍然有一些缺陷：（1）ADSCs 存活率低，尤其是在血液循環(huán)不佳的移植部位時；（2）ADSCs 有液化、囊性變等問題；（3）ADSCs 在糖尿病患者中增殖及遷移能力下降、旁分泌功能降低并且一些特異性表面標志物呈現(xiàn)低表達狀態(tài)。因此如果能解決上述問題將能更好地讓ADSCs 運用于創(chuàng)面修復的治療中。

3 NPWT 促進創(chuàng)面愈合的機制

NPWT 是近些年來的一項新技術，主要通過對創(chuàng)面滲液的持續(xù)引流，避免細菌在創(chuàng)面殘留，控制感染，減輕肉芽水腫，從而加速創(chuàng)面的愈合［11］。NPWT 主要通過以下5 個方面來促進創(chuàng)面愈合：（1）減輕組織水腫，抑制細菌生長：NPWT 通過在創(chuàng)面上施加負壓來清除創(chuàng)面的滲液、壞死組織以及細菌等，并形成密閉缺氧或低氧環(huán)境抑制創(chuàng)面細菌的生長繁殖，從而降低細菌含量，減輕組織水腫［12］。（2）促進血管再生，增加創(chuàng)面局部血流：NPWT 可以改善創(chuàng)面氧分壓及血管內皮生長因子的表達，并且負壓吸引能促進創(chuàng)面微血管直徑增大、血流速率增加、內皮細胞增殖、血管床形成增多，改善創(chuàng)面微循環(huán)［13］。（3）機械牽拉，收縮創(chuàng)面：NPWT 通過牽拉創(chuàng)面邊緣組織向中心移動，創(chuàng)面面積縮小，并引起與創(chuàng)面愈合有關的細胞變形，激活細胞骨架力學信號通路，刺激創(chuàng)面生長因子釋放，促進細胞蛋白質生成，誘導創(chuàng)面愈合細胞增殖、遷移和分化，刺激血管生成，增加創(chuàng)面微血管血容量等，從而促進創(chuàng)面愈合［14］。（4）改善微循環(huán)，促進肉芽組織形成：NPWT 中一定水平的負壓吸引可增加創(chuàng)面毛細血管再生速度，能夠改善創(chuàng)面局部血液循環(huán)，以及封閉創(chuàng)面形成的濕潤環(huán)境，均可促進創(chuàng)面肉芽組織生成［15］。（5）調節(jié)信號通路，影響細胞因子表達：NPWT 中的負壓環(huán)境可以促進TGF?β、VEGF、PDGF、FGF?2 的表達增加，以及增加MMP?1、MMP?9 的活性和降低TIMP?1 水平，并且通過阻礙c Jun 氨基末端激酶信號通路傳導，減少白細胞介素?6、腫瘤壞死因子?α、誘導型一氧化氮合酶等的生成，從而提高創(chuàng)面愈合速度［16］。雖然NPWT 在創(chuàng)面治療中的優(yōu)勢很明顯，但其仍有一些局限性：（1）創(chuàng)面嚴重感染可能造成治療失??；（2）創(chuàng)面有焦痂或壞死、創(chuàng)面感染嚴重、創(chuàng)面嚴重缺血、創(chuàng)面有活動性出血或機體有凝血功能障礙、創(chuàng)面有血管或神經或肌腱或韌帶外露、未治療的骨髓炎、惡性腫瘤、濕性壞疽等情況下禁止使用NPWT；（3）NPWT 可能存在的并發(fā)癥：如創(chuàng)面疼痛、感染、出血，局部皮炎、皮疹、皮膚剝脫、皮膚壞死，堵管、引流不暢、創(chuàng)面浸漬、敷料殘留等。 因此如果能解決上述NPWT 的局限性將能更好地讓NPWT 運用于創(chuàng)面修復的治療中。

4 ADSCs 與NPWT 聯(lián)合應用促進創(chuàng)面愈合的作用機理

目前ADSCs 移植治療創(chuàng)面存在的主要問題就是移植后存活率低，尤其在移植部位血液供應差的情況下，這使ADSCs 應用于創(chuàng)面修復中受到了極大的限制。在早期的研究中CHIN 等［17］通過在小鼠身上放置一種能夠預定張力和波形的新型皮膚拉伸裝置進行實驗，發(fā)現(xiàn)所有接受拉伸的小鼠都具有上調的表皮增殖和血管生成，表明適當?shù)钠つw牽拉能夠促進表皮的增殖和血管的生成。這項研究在一定程度上為后期研究組織外擴張與脂肪組織內ADSCs 的變化情況奠定了基礎，開拓了學者們研究組織外擴張對創(chuàng)面修復研究的新方向。目前已有多位學者通過研究組織外擴張對脂肪組織的作用發(fā)現(xiàn)，組織外擴張產生的負壓吸引能促進脂肪組織內ADSCs 的增殖。HEIT 等［18］通過連接一個外部體積膨脹裝置來治療小鼠的背部，結果發(fā)現(xiàn)外部體積擴張產生的負壓誘導皮下脂肪層、脂肪細胞和血管密度的高度增殖，并認為使用外部體積膨脹裝置的受體部位準備可能是增強細胞和組織植入的有前途的工具。LANCER?OTTO 等［19］通過對小鼠接受小型化的外部體積膨脹裝置應用的研究也得出了相似的結論，外部容量擴張產生的負壓吸引啟動了各種機制，包括機械刺激、水腫、缺血和炎癥，這些機制在不同的時間段內維持有利于細胞增殖和血管生成的環(huán)境。ORANGES 等［20］將一個由連接到-25 mmHg 抽吸源的橡膠圓頂組成的小型外部體積膨脹裝置應用于小鼠的背部并進行刺激，得出結論水腫和炎癥與外部體積膨脹的結合產生了促脂肪生成作用。GIORGIO 等［21］通過對50 只小鼠分別接受了5 種不同的間歇性外擴容積應用，得出結論中等強度間歇性體外容量擴張的應用優(yōu)化了軟組織中血管生成和脂肪生成的誘導，而不會造成組織損傷，從而在脂肪移植前具有時間有效的受體部位預處理的潛力。上述四位學者均通過在小鼠模型中使用組織外擴張進行治療，得出了相似的結論，組織外擴張產生的負壓吸引能促進細胞增殖、新血管生成和新脂肪生成。另外，LEE 等［22］在脂肪移植前對20 只白兔的背耳施加負壓并持續(xù)1 周，通過使用相同的負壓進行無創(chuàng)傷口閉合，結果顯示預擴張受體部位的血管化增加，從而提高了脂肪移植物的存活率，同樣也證明了上述觀點。而YE［23］、WEI［24］兩位學者均通過建立兩種小鼠模型，一種脂肪移植后通過外部容積擴張產生負壓吸引，另一種是單純的脂肪移植，研究得出了相同的結論外部體積擴張通過誘導再生相關細胞的遷移、脂肪細胞的分化及血管生成來提高脂肪組織移植物的存活率，進一步證明了組織外擴張產生的負壓吸引能促進脂肪組織內ADSCs 的增殖，并招募更多的宿主來源ADSCs，誘導其成脂分化，最后形成較為穏定且成熟的脂肪組織。上述研究證明NPWT 能夠促進ADSCs 移植后新血管生成，從而增強移植處的血液供應情況，進而有效的提高ADSCs 移植后的存活率；并且誘導ADSCs 成脂分化，形成穩(wěn)定且成熟的脂肪組織；最終能夠有效提高ADSCs 治療慢性創(chuàng)面的療效，為以后的臨床研究奠定了一定基礎。

炎癥反應是機體對有害刺激的一種自我防御機制，當機體受到病原體的損害或侵襲時，良好的炎癥反應調節(jié)是創(chuàng)面愈合的基本保障。巨噬細胞作為炎癥后期的一部分，是傷口愈合的關鍵，巨噬細胞刺激血管生成和纖維組織形成的作用已明確。巨噬細胞有兩種表型，以腫瘤壞死因子?α，白細胞介素?1 和白細胞介素?6 的產生為特征的M1樣細胞在修復的早期階段很常見，主要表現(xiàn)為促進炎癥反應、吞噬病原體和受損細胞，這些炎癥對宿主防御很重要，但具有組織破壞性；而M2 樣細胞則具有較少的促炎細胞因子和升高的抗炎細胞因子，主要表現(xiàn)為抗炎反應、促進組織重塑和血管生成。目前已有大量研究表明負壓吸引可以明顯降低創(chuàng)面促炎性細胞因子，從而降低炎性反應。楊帆等［25］通過研究負壓封閉引流對兔皮膚創(chuàng)面炎癥細胞趨化和炎癥因子分泌的影響發(fā)現(xiàn)負壓吸引可以使創(chuàng)面巨噬細胞計數(shù)顯著增加，并使腫瘤壞死因子?α 及白細胞介素?6 計數(shù)明顯降低而降低炎癥反應并使其局限化，促使巨噬細胞向M2 樣細胞轉變。沈童等［26］通過對糖尿病足患者進行負壓創(chuàng)面治療也得到了相似的結果，NPWT 可顯著降低糖尿病足患者血清炎癥因子腫瘤壞死因子?α、白細胞介素?6 水平，從而降低炎癥反應，促使巨噬細胞向M2樣細胞轉變。WANG等［27］通過對22名糖尿病足潰瘍患者（11 名接受NPWT 治療，另外11 名接受傳統(tǒng)清創(chuàng)治療）的研究，發(fā)現(xiàn)NPWT 顯著降低腫瘤壞死因子?α、白細胞介素?6 和誘導型一氧化氮合酶的表達，并且其發(fā)揮抗炎作用可能是通過抑制IB?α 抑制和ATF?3 激活引起的促炎酶和細胞因子，這也證明了NPWT 可以降低炎癥反應，促使巨噬細胞向M2 樣細胞轉變。而又有研究表明M2 巨噬細胞能夠提高自體脂肪移植物的存活率，PHIPPS等［28］通過將帶有鹽水或M2 巨噬細胞的移植物注射到受體小鼠頭皮下并觀察脂肪移植物的體積及血管密度，發(fā)現(xiàn)M2 巨噬細胞補充的移植物體積保持穩(wěn)定、血管密度增加明顯，得出結論M2 巨噬細胞通過誘導血管生成提高小鼠模型中自體脂肪移植物的存活率。ETO 等［29］通過研究發(fā)現(xiàn)了新的M2 巨噬細胞群體，其表達CD34 和CD206，M2 巨噬細胞具有與脂肪干細胞ASC 相似的特征，包括粘附、定位、形態(tài)和間充質多能性，對脂肪組織的維持和重塑很重要。而負壓吸引可以促進創(chuàng)面巨噬細胞M2 樣轉變，因此M2 樣巨噬細胞可以向血管內皮細胞及前脂肪細胞分化，從而促進血管形成及脂肪組織再生。綜上所述NPWT 可以促進巨噬細胞M2 樣轉變，然后通過誘導血管生成來提高自體脂肪移植物的存活率，并促進血管形成及脂肪組織再生，進而有效的促進創(chuàng)面愈合。

通過上述多項研究得出負壓環(huán)境不僅可以增加創(chuàng)面愈合早期階段的微血管生成數(shù)量，還可以促進創(chuàng)面愈合后期產生穩(wěn)定的環(huán)境，并由此促進創(chuàng)面微血管的穩(wěn)定和成熟，從而改善創(chuàng)面的血流灌注情況，提高移植物的成活率，進而影響創(chuàng)面的愈合情況；自體脂肪干細胞移植能夠形成創(chuàng)面修復所需的微環(huán)境、促進血管生成及鄰近細胞的遷移，從而促進創(chuàng)面愈合；并且二者均可產生大量有助于創(chuàng)面愈合的生長因子。因此將ADSCs 與NPWT 聯(lián)合應用既可以解決一些單一NPWT 無法解決的慢性創(chuàng)面問題，又可以增加ADSCs 移植后的存活率，還能夠相互作用產生更多的生長因子，二者相輔相成，能夠更好的用于慢性創(chuàng)面的治療，給慢性創(chuàng)面又提供了一種新的治療思路。

5 ADSCs 與NPWT 聯(lián)合應用促進創(chuàng)面愈合的臨床研究

脂肪組織是多能干細胞的主要來源之一，將脂肪組織經抽吸、乳化、離心除去水和油脂后可得脂肪微粒，ADSCs 主要存在于此。漆白文等［30］選取了15 例糖尿病足患者，將自體脂肪微粒覆蓋創(chuàng)面，覆蓋凡士林紗布，并用VSD 敷料覆蓋創(chuàng)面用負壓持續(xù)吸引2 ～ 3 周，每周更換負壓敷料1 次，3 周后拆除VSD 裝置，對殘存的較大創(chuàng)面行植皮治療，較小的創(chuàng)面定期換藥處理。5 例小面積創(chuàng)面在術后21 ～ 36 d 愈合；10 例較大面積17 ～ 25 d 愈合，在3 ～ 6 個月的隨訪期間，所有患者傷口依然保持閉合，無并發(fā)癥存在。在SOUZA 等［31］的研究中，一名59 歲的男性患者自幼患有慢性左脛骨骨髓炎行脛骨遠端部分清創(chuàng)術，用于手術傷口初步閉合的后內側筋膜皮瓣出現(xiàn)部分壞死。皮瓣清創(chuàng)后通過脂肪移植（FG）與NPWT 治療，經過三周的治療，肉芽組織覆蓋了所有的創(chuàng)面，然后通過皮膚移植使傷口完全愈合，該研究表明這種新療法有效。在BIYAO 等［32］的研究中，一名65 歲女性患者右腳有嚴重糖尿病足潰瘍，進行了外科清創(chuàng)術、自體脂肪移植（AFG）和NPWT 聯(lián)合應用，治療一段時間后肉芽組織覆蓋整個傷口，然后通過分層皮膚移植閉合傷口。術后1 個月，患者糖尿病足潰瘍完全愈合并且無復發(fā)，這也證明了聯(lián)合使用AFG 和NPWT 的療效。楊昭偉等［33］篩選了慢性創(chuàng)面患者15 名，實驗組8 例使用ADSCs 及NPWT 聯(lián)合治療，對照組7 例單獨使用NPWT 治療，治療10 d 后實驗組的創(chuàng)面愈合率、真皮層膠原沉積、新生血管數(shù)量均高于對照組，這項研究證明ADSCs 及NPWT 聯(lián)合治療的臨床效果是積極明顯的。綜上所述，上述幾項研究證明了ADSCs 及NPWT 聯(lián)合治療具有創(chuàng)傷小、臨床可行性強等優(yōu)點，能有效促進慢性創(chuàng)面的愈合，并且相對于單一的ADSCs 或NPWT 治療慢性創(chuàng)面效果更佳，是治療慢性創(chuàng)面安全而有效的一種新方法，并且有望通過這種新的治療方法去解決一些使用單一ADSCs 或NPWT 治療方法無法解決的一些慢性創(chuàng)面問題，在給患者帶來更好的治療方法的同時還為臨床工作者們打開了思路：可以將多種單一的治療方法相結合可能會有更好的療效。

6 總結與展望

綜上所述，ADSCs 與NPWT 聯(lián)合使用可有效促進慢性創(chuàng)面的愈合，并且療效顯著。ADSCs 來源廣泛，取材方便，對供區(qū)損傷極小，且倫理學限制較少，并且免疫排斥反應也較少，臨床應用前景廣闊。NPWT 能有效提高慢性創(chuàng)面愈合率、縮短愈合時間、降低不良風險，尤其適用于不能耐受多次手術清創(chuàng)的患者。二者聯(lián)合使用達到了相輔相成的作用，既解決了單一NPWT 無法解決的慢性創(chuàng)面，又有效的提高了ADSCs 的存活率，并促進血管形成及脂肪組織再生，還能夠相互作用產生更多的生長因子，較單一的ADSCs 或NPWT 治療均有明顯的療效提升，是治療慢性創(chuàng)面安全而有效的一種新方法。然而為了更進一步評估該治療的有效性，還需要進行ADSCs 和NPWT 聯(lián)合應用與單一方法治療創(chuàng)面相對比的大樣本隨機對照臨床試驗。除此之外，在大量ADSCs 和NPWT 聯(lián)合應用的研究中，對于ADSCs 的分離提取沒有標準化方案，聯(lián)合使用時負壓吸引的壓力最佳值是多少也不統(tǒng)一。希望未來有更多的學者致力于研究ADSCs 與NPWT 聯(lián)合使用治療慢性創(chuàng)面，使這種治療方案能夠更早、更廣泛的在臨床上得到應用。