非ST段抬高型急性心肌梗死患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后高殘留血小板活性與血小板表面Ⅱb/Ⅲa受體、P?選擇素及預(yù)后的關(guān)系

劉軍 賈志 霍立巍

天津市北辰醫(yī)院心內(nèi)科（天津 300400）

非ST 段抬高型急性心肌梗死（non ST segment elevation acute myocardial infarction，NSTEMI）是臨床常見(jiàn)的急性心肌缺血性疾病，多發(fā)于40 歲以上的中老年人群［1］。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percu?taneous coronary intervention，PCI）后雙聯(lián)抗血小板治療可降低后期缺血性事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［2-4］，但依然有10%～15%的患者在堅(jiān)持應(yīng)用雙聯(lián)抗血小板治療后仍再發(fā)缺血性事件。高殘留血小板活性（high residual platelet reactivity，HRPR）是指負(fù)荷劑量的抗血小板藥物下血小板仍有較高的反應(yīng)活性，目前的觀點(diǎn)認(rèn)為HRPR 是PCI 后雙聯(lián)抗血小板治療再發(fā)缺血事件的重要原因［5-6］。Ⅱb/Ⅲa 受體是血小板激活后共同的最終通路，激活的受體與纖維蛋白原相互作用介導(dǎo)血小板的聚集，Ⅱb/Ⅲa 受體拮抗劑一直是強(qiáng)效的抗血小板藥物［7］。P?選擇素是血小板激活的標(biāo)志物，當(dāng)血小板激活時(shí)P?選擇素的表達(dá)水平會(huì)升高［8］。GOLUKHOVA 等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，PCI 術(shù)前血漿P?選擇素水平是PCI 術(shù)后HRPR 的危險(xiǎn)因素。本研究旨在探討NSTEMI 患者PCI 術(shù)后HRPR 與血小板表面Ⅱb/Ⅲa 受體、P?選擇素及預(yù)后的關(guān)系，以期探討HRPR 影響患者預(yù)后的可能作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果整理如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用前瞻性研究的方法，于2019年1月至2019年10月收集在我院行PCI 手術(shù)治療的NSTEMI 患者214 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均參考2016年中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)制定的指南中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)確診［9］；（2）首次進(jìn)行PCI 術(shù)，且支架植入成功者；（3）患者對(duì)本次研究?jī)?nèi)容均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）治療依從性欠佳，出院后未能按醫(yī)囑服藥者；（2）合并重度貧血、惡性腫瘤、凝血功能障礙等嚴(yán)重疾病者；（3）因冠脈瘤、冠脈夾層等其他原因所致的心肌梗死；（4）既往患有心臟瓣膜病、心肌炎等心臟疾?。唬?）嚴(yán)重肝腎功能障礙者。本實(shí)驗(yàn)獲得本院倫理委員會(huì)的同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 流式細(xì)胞儀（FACSArial，美國(guó)BD公司）、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（PowerWave XS，美國(guó)BIO?TEK公司）、血小板聚集儀（CHRONO?LOG）、低溫離心機(jī)（Z 400K，德國(guó)HERMLE 公司）、96 孔板（Becton Dickinson）、微量加樣器（Eppendorf）。

1.3 主要溶劑及配制 主要溶劑：FITC?PAC?1（Becton Dickinson，貨號(hào)：340507）、Alexa fluor 647?抗CD62p 抗體（Thermo Fisher，貨號(hào)：A20186）、PAC?1（Biorbyt，貨號(hào)：orb652037）、抗CD62p 抗體（Abcam，貨號(hào)：BW8065）。主要配制溶液：Tyrode′s buffer：1 L液體中包含Hepes 3.575 g，NaH2PO40.59 g，NaCl 8.065 g，KCl 0.2 g，MgCl20.42 g，5%Glucose 1.09 g，BSA 2 g，pH 范圍在7.35～7.45。

1.4 方法

1.4.1 制備血小板 所有受檢者均于PCI術(shù)后3 d清晨在空腹?fàn)顟B(tài)下肘靜脈采血5 mL，血液流入枸櫞酸鈉抗凝管后，要輕輕顛倒2 ～ 3 次，使其充分混合，不可有凝塊。上述血標(biāo)本以200 μg離心13 min，提取上層獲得富血小板血漿。

1.4.2 檢測(cè)血小板聚集率 血小板聚集儀檢測(cè)血小板聚集率，在測(cè)定樣品杯中加入一小磁棒和495 μL 富含血小板血漿置恒溫孔中預(yù)熱5 min 備用。進(jìn)入Aggrolink 界面，按照說(shuō)明書設(shè)置參數(shù)，打開反應(yīng)倉(cāng)，加入誘導(dǎo)劑1 mmol/L ADP 5 μL，反應(yīng)時(shí)間為6 min。按“Calculate slope Amiplitute”鍵，按：“ok”鍵讀取結(jié)果。

在進(jìn)行血小板聚集率抑制試驗(yàn)時(shí)，在樣品杯中預(yù)先加入5 μL PAC?1 或抗CP62p 抗體，再對(duì)血小板聚集率進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟與上方一致。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板Ⅱb/Ⅲa水平及P?選擇素的水平 取45 μL Tyrode′s buffer 加入流式管中，加入5 μL 全血，加入5 μL FITC?PAC?1 和5 μL Alexa fluor 647?抗CD62p 抗體避光15 min 后加入200 μL Tyrode′s buffer。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PAC?1+/CD62p+、PAC?1-/CD62p+、PAC?1+/CD62p-血小板水平。

1.5 分組方法以及隨訪方法 根據(jù)患者的血小板聚集率進(jìn)行分組，若血小板聚集率≥70%則納入到HRPR 組，血小板聚集率＜70%則納入到LRPR組［11］。PCI 術(shù)后根據(jù)《非ST 段抬高型急性冠狀動(dòng)脈綜合征診斷和治療指南（2016）》中的意見(jiàn)進(jìn)行規(guī)范性治療，術(shù)后隨訪1年，主要隨訪方式為電話隨訪和門診復(fù)查，觀察患者是否有缺血事件發(fā)生，缺血事件主要包括：再發(fā)心絞痛、再發(fā)心肌梗死、血栓形成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，采用Pearson 法分析相關(guān)性，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料 本實(shí)驗(yàn)共有214 例NSTEMI患者入組，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行了PCI 手術(shù)及雙聯(lián)抗血小板方案治療。根據(jù)術(shù)后3 d 采血檢測(cè)血小板聚集率進(jìn)行分組，其中HRPR 組28 例，血小板聚集率為（76.3±4.4）%，LRPR 組186 例，血小板聚集率為（41.6 ± 16.7）%。兩組患者的年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙史、高血壓、糖尿病、心肌梗死、PCI病史及左心室射血分?jǐn)?shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 HRPR 組和LRPR 組患者基本資料比較Tab.1 Comparison of basic data of patients in HRPR group and LRPR group 例（%）

2.2 血小板PAC?1及CD62p水平比較 流式細(xì)胞儀檢測(cè)了兩組患者血小板Ⅱb/Ⅲa（PAC?1）及P?選擇素（CD62p）水平。如圖1 所示，HRPR 組PAC?1+/CD62p+、PAC?1-/CD62p+、PAC?1+/CD62p-血小板水平高于LRPR 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 10.573，9.121、11.496，均P＜0.001）。

圖1 兩組患者PAC?1+/CD62p+、PAC?1-/CD62p+、PAC?1+/CD62p-血小板水平Fig.1 PAC?1+/CD62p+，PAC?1-/CD62p+，PAC?1+/CD62pplatelet levels of the two groups of patients

2.3 血小板PAC?1 及CD62p 水平與血小板聚集率的相關(guān)性分析 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析血小板Ⅱb/Ⅲa（PAC?1）及P?選擇素（CD62p）水平與血小板聚集率水平的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，血小板聚集率水平與PAC?1+/CD62p+（r= 0.302，P= 0.023）、PAC?1+/CD62p-（r=0.319，P= 0.012）水平呈正相關(guān)，而PAC?1-/CD62p+水平與血小板聚集率之間無(wú)相關(guān)性（r= 0.264，P=0.097）。

2.4 血小板聚集率抑制試驗(yàn) PAC?1 及抗CD62p抗體預(yù)先孵育血小板后檢測(cè)血小板的聚集率變化，見(jiàn)圖2，PAC?1 預(yù)先孵育血小板后，HRPR 組以及LRPR 組血小板聚集率明顯降低（t= 15.827，23.204，均P＜0.001）；抗CD62p 抗體預(yù)先孵育血小板后，HRPR 組以及LRPR 組血小板聚集率并無(wú)明顯變化（t=1.656、1.509，P=0.103、0.132）。

圖2 血小板聚集率抑制試驗(yàn)Fig.2 Platelet aggregation rate inhibition test

2.5 兩組患者缺血不良事件 隨訪1年后HRPR組有6 例患者出現(xiàn)缺血事件，22 例患者未出現(xiàn)缺血事件，發(fā)生率為21.4%；LRPR 組有13 例患者出現(xiàn)缺血事件，7 例患者失訪，166 例患者未出現(xiàn)缺血事件，缺血事件發(fā)生率為7.3%。兩組缺血不良事件差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.253，P=0.039）。

3 討論

NSTEMI 是由于心臟血供障礙引起的缺血性心血管疾病，血栓形成是導(dǎo)致缺血事件的重要原因，因此防止血栓形成是臨床預(yù)防缺血事件再發(fā)的重中之重［12-13］?！斗荢T 段抬高型急性冠狀動(dòng)脈綜合征診斷和治療指南（2016）》中強(qiáng)調(diào)了NSTEMI治療中雙聯(lián)抗血小板方案的重要性［10］，該治療方案可有效防止血栓形成，但依然有部分患者會(huì)出現(xiàn)缺血事件。研究顯示［14］，HRPR 與急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者臨床缺血事件的發(fā)生具有相關(guān)性。Ⅱb/Ⅲa 受體、P?選擇素均與血小板的激活密切相關(guān)，但目前研究相對(duì)缺乏。

本研究結(jié)果顯示，HRPR 組患者Ⅱb/Ⅲa 受體（PAC?1+）水平明顯高于LRPR 組。相關(guān)性分析顯示Ⅱb/Ⅲa 受體與血小板聚集水平呈正相關(guān)，提示Ⅱb/Ⅲa 受體水平與血小板的聚集率密切相關(guān)。抑制試驗(yàn)顯示加入PAC?1 后，血小板的聚集率明顯下降，說(shuō)明HRPR 組患者高血小板聚集率與由高水平的Ⅱb/Ⅲa 受體存在密切的關(guān)系。隨訪發(fā)現(xiàn)，HRPR 組患者缺血事件發(fā)生率明顯高于LRPR組患者，說(shuō)明高水平的Ⅱb/Ⅲa 受體與PCI 術(shù)后缺血事件再發(fā)生密切相關(guān)，相關(guān)研究也顯示［15］，2 型糖尿病患者Ⅱb/Ⅲa 受體高表達(dá)則預(yù)示著發(fā)生心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)較高。之前的研究顯示Ⅱb/Ⅲa抑制劑能夠降低氯吡格雷抵抗或阿司匹林抵抗的患者缺血事件的發(fā)生［16］，這也可以說(shuō)明血小板高水平的Ⅱb/Ⅲa 是導(dǎo)致PCI 術(shù)后缺血事件再發(fā)的重要原因。另一方面，HRPR 組患者的P?選擇素（CD62p+）水平雖然明顯高于LRPR 組，但相關(guān)性分析顯示P?選擇素水平與血小板聚集水平無(wú)關(guān)，且抑制試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了血小板聚集率受Ⅱb/Ⅲa 受體水平影響，而與P?選擇素水平無(wú)明顯的關(guān)系。GOLUKHOVA 等［9］的研究發(fā)現(xiàn)PCI 術(shù)前血漿中的P?選擇素水平是PCI 術(shù)后HRPR 的危險(xiǎn)因素。造成本研究結(jié)果與GOLUKHOVA 等不同原因，一方面可能是本文檢測(cè)的是血小板表面的P?選擇素的水平，而后者檢測(cè)的是血漿中P?選擇素水平，另一方面是兩個(gè)實(shí)驗(yàn)研究的時(shí)間節(jié)點(diǎn)的不同，本文研究的是PCI 術(shù)后雙聯(lián)抗血小板方案治療后，而后者主要研究的是PCI 術(shù)前。更為重要的是，筆者認(rèn)為P?選擇素主要介導(dǎo)血小板與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及T 淋巴細(xì)胞亞群的相互作用，并不直接參與血小板聚集［17］；只有當(dāng)其與白細(xì)胞的相互作用過(guò)程中激活Ⅱb/Ⅲa 受體時(shí)才能促進(jìn)血小板的聚集，這也是PAC?1+/CD62p+水平與血小板聚集率卻有相關(guān)性的原因［18］。

綜上所述，NSTEMI 患者PCI 術(shù)后HRPR 與血小板表面Ⅱb/Ⅲa 受體有關(guān)，與P?選擇素?zé)o關(guān)。HRPR 可增加NSTEMI 患者PCI 術(shù)后缺血事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。本研究雖初步驗(yàn)證了HRPR 與血小板表面Ⅱb/Ⅲa 受體的關(guān)系，但由于納入的病例數(shù)較少，且為單中心研究，以上結(jié)論還有待大型研究進(jìn)行驗(yàn)證。此外，還需要更多更加深入的基礎(chǔ)研究進(jìn)一步分析血小板表面Ⅱb/Ⅲa 受體影響血小板的聚集率的作用機(jī)制，為臨床更好的防止NSTEMI患者PCI 術(shù)后再發(fā)缺血事件提供科學(xué)的指導(dǎo)。