抗生素對首次種植失敗合并慢性子宮內(nèi)膜炎女性再次凍融胚胎移植結(jié)局的影響研究

魏瓏瓏，張翠蓮

本研究創(chuàng)新性：

（1）本研究首次將目標人群集中在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）首次種植失敗人群，以期早期、快速的尋找種植失敗患者存在的可能病因，并進行干預(yù)和治療，減少該類患者的經(jīng)濟和心理負擔(dān)。（2）本研究發(fā)現(xiàn)在IVF-ET首次種植失敗人群中，慢性子宮內(nèi)膜炎（CE）存在一定的發(fā)生比例，且證實了口服抗生素治療對于改善該類患者再次助孕結(jié)局具有積極意義，該結(jié)論對于臨床工作有較大的指導(dǎo)意義。

本研究局限性：

（1）本研究屬回顧性研究，樣本量有限，組間差異較大，可能對統(tǒng)計結(jié)果產(chǎn)生不良影響；（2）本研究為單中心研究，手術(shù)醫(yī)師經(jīng)驗及病理診斷水平也可能存在與其他研究單位標準不一致的情況；（3）現(xiàn)行CE診斷標準尚不統(tǒng)一，不利于研究人群納入標準的設(shè)立，同時不同研究之間難以相互比較分析。

慢性子宮內(nèi)膜炎（CE）是一種子宮內(nèi)膜受到病原微生物感染而發(fā)生的慢性炎癥，是以子宮內(nèi)膜間質(zhì)漿細胞浸潤為特征的持續(xù)、隱匿性感染［1］。CE對女性生育力可產(chǎn)生不良影響，CE在不孕人群中的患病率為40.8%～57.0%，在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）反復(fù)種植失?。≧IF）患者中可達14.0%～57.6%［2-3］。然而，CE在IVF-ET首次種植失敗人群中發(fā)生率的研究較少。CE的主要病因是病原微生物感染，目前國內(nèi)外公認的治療方式是抗生素治療，其中多西環(huán)素被列為一線治療用藥。眾多研究表明，規(guī)范應(yīng)用抗生素能有效治療CE，改善患者的生殖預(yù)后［4］。本文旨在研究首次種植失敗患者人群中的CE流行情況以及經(jīng)過抗生素治療后對其再次凍融胚胎移植結(jié)局的影響，以期提前發(fā)現(xiàn)病因，盡早進行干預(yù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年5月至2021年5月于河南省人民醫(yī)院行IVF-ET首次種植失敗的381例患者為研究對象。納入標準：（1）年齡＜40歲；（2）首次至少移植了1枚高評分卵裂期胚胎或1枚高評分囊胚；（3）移植日內(nèi)膜厚度介于8～14 mm之間。胚胎評分標準為：（1）高評分卵裂期胚胎：①卵裂球在第3天為7～9個；②胚胎碎片比例≤5%；③原核期無多核。（2）高評分囊胚：3BB、4BB及以上評分中不含C的囊胚［5］。排除標準：（1）合并其他宮腔病變者，如內(nèi)膜息肉、宮腔粘連、子宮縱隔、子宮肌瘤等；（2）合并輸卵管積水者；（3）夫妻一方或雙方染色體異常者；（4）卵巢功能低下者；（5）經(jīng)明確診斷的免疫相關(guān)疾病者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎等；（6）經(jīng)超聲檢查發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥；（7）術(shù)前合并生殖道炎癥、發(fā)熱、咳嗽及相關(guān)手術(shù)禁忌證者。本研究經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會審批（SYSZ-LL-2021091501）。

1.2 研究方法 收集患者的臨床資料〔年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、不孕年限、首次移植日內(nèi)膜厚度、首次移植胚胎數(shù)、不孕類型（原發(fā)不孕、繼發(fā)不孕）〕和患者再次凍融胚胎移植的妊娠結(jié)局（種植率、妊娠率、流產(chǎn)率）。

1.2.1 宮腔鏡檢查術(shù)及內(nèi)膜活檢術(shù) 患者均完善各項術(shù)前檢查，排除明顯手術(shù)禁忌后行宮腔鏡檢查術(shù)。CE在宮腔鏡下的表現(xiàn)為［3］：（1）充血：血管網(wǎng)凸出，在腺體周圍更加明顯；（2）間質(zhì)水腫：卵泡期子宮內(nèi)膜在增殖期依舊蒼白增厚；（3）局灶或彌漫性微小息肉：子宮內(nèi)膜表面有小于1 mm蒂狀凸起。對于宮腔鏡下存在CE特征性表現(xiàn)的患者術(shù)畢行宮腔全面搔刮術(shù)，收集內(nèi)膜組織進行常規(guī)病理檢查，并行免疫組化染色。宮腔鏡檢查均由1至2名固定的副主任醫(yī)師完成。見圖1。

圖1 宮腔鏡下CE的特征性表現(xiàn)Figure 1 Characteristics of chronic endometritis under hysteroscopy

1.2.2 CE的診斷標準 所取內(nèi)膜切片均進行常規(guī)病理檢查行蘇木精-伊紅染色（HE），以尋找漿細胞。鏡下判斷漿細胞的標準是胞體大、核漿比高、堿性細胞質(zhì)和胞核中異染色質(zhì)呈“輪輻狀”放射排列等。同時采用跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖（CD138）作為漿細胞的特異性標志物進行免疫組化染色［6］。CE診斷標準：宮腔鏡下存在CE特征性表現(xiàn)聯(lián)合CD138陽性即確診為CE。

1.2.3 CE的治療策略 術(shù)后所有患者進行常規(guī)的抗感染治療，口服頭孢克洛（禮來蘇州制藥有限公司，國藥準字 H20020571）2 次 /d，0.25 g/次，共計 3 d。同時指導(dǎo)CE患者口服鹽酸多西環(huán)素腸溶膠囊（永信藥品工業(yè)股份有限公司，國藥準字H20030627），2次/d，100 mg/次，聯(lián)合甲硝唑片（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20057236），2次 /d，400 mg/次，總計 14 d為一療程。

1.3 分組情況 治療結(jié)束后再次復(fù)查宮腔鏡，術(shù)中取內(nèi)膜組織進行CD138免疫組化染色判斷治療效果。根據(jù)抗生素治療后患者CE轉(zhuǎn)歸情況分為CE轉(zhuǎn)陰組（n=37）及CE持續(xù)陽性組（n=11），宮腔鏡下無CE表現(xiàn)（n=27）及病理檢查排除CE（n=306）分為非CE組（n=333）。根據(jù)患者需求進行再次胚胎移植。分組流程見圖2。

圖2 研究人群入組情況Figure 2 Process of grouping and subgrouping of participants

1.4 凍融胚胎移植 按照玻璃化解凍常規(guī)對胚胎進行解凍、復(fù)蘇。在超聲引導(dǎo)下進行胚胎移植操作。卵裂期胚胎每次移植不超過2枚，囊胚優(yōu)先建議單囊胚移植。術(shù)后常規(guī)進行黃體支持。

1.5 再次凍融胚胎移植的妊娠結(jié)局相關(guān)指標的觀察治療后安排患者進行胚胎植入手術(shù)，術(shù)后14 d進行妊娠檢測，術(shù)后28 d及35 d進行陰道超聲檢查。確定妊娠后整個孕期進行密切隨訪，及時登記分娩及新生兒出生情況。

胚胎種植率=孕囊數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠患者數(shù)/總移植患者數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=自然流產(chǎn)患者數(shù)/臨床妊娠患者數(shù)×100%。本研究中所記錄的自然流產(chǎn)均發(fā)生在妊娠12周之前，即為早期流產(chǎn)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，多組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組臨床資料比較 CE轉(zhuǎn)陰組、CE持續(xù)陽性組及非CE組年齡、BMI、移植日內(nèi)膜厚度、不孕年限、移植胚胎數(shù)、不孕類型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data among the three groups

2.2 三組妊娠結(jié)局比較 CE轉(zhuǎn)陰組、CE持續(xù)陽性組、非CE組胚胎種植率、臨床妊娠率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中非CE組、CE轉(zhuǎn)陰組胚胎種植率、臨床妊娠率均高于CE持續(xù)陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CE轉(zhuǎn)陰組、非CE組胚胎種植率、臨床妊娠率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；三組早期流產(chǎn)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 三組再次凍融胚胎移植的妊娠結(jié)局比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of outcomes of frozen-thawed embryo retransfer among the three groups

3 討論

CE指局限于子宮內(nèi)膜的持續(xù)性慢性炎癥，其病理學(xué)特點是漿細胞的子宮內(nèi)膜間質(zhì)浸潤［7］。近年來，隨著宮腔鏡檢查的普及以及病理診斷技術(shù)的不斷提高，CE被發(fā)現(xiàn)與多種女性生殖疾病相關(guān)，包括不孕癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、RIF、子宮內(nèi)膜息肉及子宮內(nèi)膜異位癥等［3-4］。其中，RIF作為輔助生殖領(lǐng)域的熱點和難點，被醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。大量研究顯示，RIF患者CE的患病率為7.7%～66.0%，同時積極的抗生素治療可明顯改善CE患者的妊娠結(jié)局［3，8-10］。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于CE在IVF-ET首次種植失敗患者中發(fā)病情況及抗生素治療后是否對該類患者再次凍融胚胎移植結(jié)局有益的相關(guān)研究。眾所周知，輔助生殖技術(shù)的花費較高、周期較長、復(fù)診次數(shù)多，給患者造成了較大的經(jīng)濟負擔(dān)；此外，不孕年限長、多次移植失敗會進一步加重患者的心理負擔(dān)，而焦慮和緊張的情緒反過來又會對生殖預(yù)后產(chǎn)生不利影響，陷入惡性循環(huán)。因而，早期、快速尋找種植失敗患者存在的可能病因，并進行干預(yù)和治療意義重大。

CE的臨床表現(xiàn)輕微且缺乏特異性，極易被忽視。宮腔鏡檢查是發(fā)現(xiàn)CE的最直觀手段，但大多數(shù)研究不推薦單一宮腔鏡檢查作為確診CE的標準［11］。目前，CE的診斷主要基于內(nèi)膜組織病理檢查中發(fā)現(xiàn)漿細胞浸潤。HE染色是最常用的方法，但其也有一定的局限性，如患者取樣時處于月經(jīng)周期的不同階段造成的觀測誤差以及組織中的漿細胞難以辨別等［12］。近年來，越來越多的研究提出采用漿細胞的特異性標志物CD138輔助診斷CE，其通過免疫組化染色的方法，特異性標記內(nèi)膜間質(zhì)中的漿細胞，可以明顯提高診斷的效率［13］?；仡檱鴥?nèi)外文獻，每張切片中總體的漿細胞個數(shù)、每1個或10個高倍視野（HPF）下漿細胞及多個高倍視野下漿細胞個數(shù)的平均數(shù)均可用來作為判斷標準。且不同的研究中診斷CE的漿細胞個數(shù)也不一致，有學(xué)者以≥5個CD138陽性標記的漿細胞為陽性；另外，還有學(xué)者用漿細胞密度（PCD）作為診斷CE的標準［8，14-15］。CICINELLI等［16］研究將 1～4個漿細胞 /HPF 定義為輕度CE，≥5個漿細胞/HPF定義為重度CE，且發(fā)現(xiàn)宮腔鏡聯(lián)合CD138免疫組化檢查可以提高輕度CE患者診斷的準確性。因而本研究提出宮腔鏡下存在CE特征性表現(xiàn)聯(lián)合CD138陽性作為CE的診斷標準，而未強調(diào)具體的CD138計數(shù)，以期提高CE的檢出率。

本研究納入的目標人群為40歲以下、卵巢儲備功能正常的女性群體，移植日內(nèi)膜厚度在8～14 mm之間，均經(jīng)歷了首次胚胎種植失??；同時排除了可能影響胚胎種植的因素，如輸卵管積水、先天性及獲得性子宮解剖功能異常、子宮內(nèi)膜異位癥等。本研究發(fā)現(xiàn)，在IVF-ET首次種植失敗的女性群體中，CE發(fā)生比例達12.6%。CE引起胚胎種植失敗的可能機制包括：CE可造成細胞因子、生長因子和凋亡相關(guān)蛋白的表達異常，進而降低子宮內(nèi)膜的容受性，導(dǎo)致種植失敗的發(fā)生；同時，CE可以誘發(fā)子宮內(nèi)膜局部的免疫微環(huán)境和炎癥微環(huán)境的改變，阻礙內(nèi)膜蛻膜化的過程以及胚胎的黏附、穿透以及滋養(yǎng)細胞的侵襲過程［17-18］。

CE最主要的病因是病原微生物感染，其常見的致病菌包括鏈球菌、大腸埃希菌、糞腸球菌、葡萄球菌、變形桿菌、生殖道支原體和衣原體等［19］。目前，CE公認的治療方法是規(guī)范口服抗生素。一線用藥是廣譜抗生素多西環(huán)素（100 mg/次，2次 /d，14 d），多西環(huán)素的抗菌譜使其對細菌和支原體均有效；而甲硝唑主要針對厭氧菌感染，結(jié)合目前實際臨床工作，本研究采用多西環(huán)素及甲硝唑聯(lián)合治療CE。多項研究均證實了口服抗生素對CE的治療效果及其對生殖預(yù)后的改善作用。KITAYA等［19］發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素對于CE的治愈率為92.3%，累積的總治愈率為99.1%；JOHNSTONMACANANNY等［18］發(fā)現(xiàn)采用多西環(huán)素治療后，治愈率達70%，對部分多西環(huán)素不敏感的患者進行聯(lián)合用藥后再次復(fù)查，內(nèi)膜活檢提示漿細胞清除效果良好.在本研究中，CE組患者均經(jīng)過足量規(guī)范的口服抗生素治療后復(fù)查，CE治愈率為77.08%（37/48），與以上研究結(jié)果一致，再次證明了規(guī)范抗生素治療CE的顯著作用。在本研究中，再次進行凍融胚胎移植后，CE轉(zhuǎn)陰組患者胚胎種植率及臨床妊娠率明顯高于CE持續(xù)陽性組，這一結(jié)論與國內(nèi)外研究結(jié)果一致［3，19］。值得注意的是，本研究結(jié)果顯示，CE轉(zhuǎn)陰組患者在種植率與臨床妊娠率方面均高于非CE組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，該結(jié)果也在其他同類型研究中得到了支持［3，19］。分析產(chǎn)生以上結(jié)果的原因可能是：（1）宮腔鏡檢查對于胚胎著床也有一定的積極作用，可能與膨?qū)m液沖刷宮腔刺激著床因子分泌增加有關(guān)；（2）多項研究支持內(nèi)膜刺激、診刮對于著床失敗有較大的幫助，很多生殖中心將內(nèi)膜診刮作為治療RIF的重要措施［20-22］。本研究結(jié)果表明，合理使用抗生素不僅可以有效治愈CE，還可以顯著改善IVF-ET首次種植失敗患者的生殖預(yù)后，具有非常重要的臨床意義。

綜上所述，CE在首次種植失敗的患者中發(fā)生率高，推薦積極進行宮腔鏡檢查，尋找可能的病因；確診為CE的患者應(yīng)采用規(guī)范的抗生素治療，未治愈的CE將對再次凍融胚胎移植的結(jié)局產(chǎn)生影響。在未來的研究中，應(yīng)盡快進行多中心、大樣本的研究以確定統(tǒng)一、規(guī)范的CE診斷標準，避免漏診及過度治療。同時，胚胎植入是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，CE僅為其影響因素之一，在臨床工作中需要多方面的綜合考慮和干預(yù)，以便為該類患者提供更有效的建議和個體化的治療方案。

作者貢獻：魏瓏瓏進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，負責(zé)數(shù)據(jù)整理、分析及論文撰寫；張翠蓮負責(zé)研究指導(dǎo)、論文修改及經(jīng)費支持，并對文章整體負責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。