苧麻干粉綠原酸提取液體外替代抗生素研究

廖暑杰，王 丹，張昆朋，唐艷儀，揭雨成,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，湖南 長沙 410128；2.湖南省草類作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用工程技術(shù)研究中心， 湖南 長沙 410128）

抗生素的合成是醫(yī)藥領(lǐng)域最偉大的成就之一，但長期反復(fù)使用抗生素導(dǎo)致細(xì)菌耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)。據(jù)統(tǒng)計，我國每年有8 萬人死于濫用抗生素。倍受人們關(guān)注的是，長期采食添加抗生素飼料的動物，其體內(nèi)的微生物產(chǎn)生抗藥性后通過食物鏈進(jìn)入人體，導(dǎo)致人體也產(chǎn)生抗藥性的問題。而中草藥作為一種綠色安全的天然添加劑，可直接或間接作用于細(xì)菌等有害微生物，且不產(chǎn)生耐藥性[1]。綠原酸（Chlorogenic acid），分子式為C16H18O9，分子量354.31[2]。目前人們對綠原酸的研究已深入到食品、保健、醫(yī)藥和日用等多個領(lǐng)域。它是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[3]。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)從綠色植物中提取的綠原酸能夠抑制和殺滅多種致病細(xì)菌。洪亮等[4]在金銀花、山銀花提取物綠原酸進(jìn)行體內(nèi)外抑菌試驗中發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抑菌作用。周志娥等[5]在研究綠原酸、異綠原酸A 對大腸桿菌抑菌機(jī)制中發(fā)現(xiàn)二者均可破壞細(xì)菌細(xì)胞壁、膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞通透性增加，內(nèi)容物外泄。王明英等[6]發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物對大腸桿菌，沙門氏菌等腸道菌具有一定的抑制作用。

肖傳明等[7]在肉雞日糧中添加植物提取物替代抗生素進(jìn)行試驗，結(jié)果表明，與抗生素組相比，試驗組能顯著提高肉雞酶活力和消化率。唐保國等[8]在肉雞基礎(chǔ)日糧中分別添加由姜黃、柴胡、魚腥草、靈香草等組成的中草藥復(fù)方提取物（100 mg/kg）和吉他霉素（10 mg/kg）、金霉素+洛克沙砷（75+35 mg/kg）、黃霉素（5 mg/kg），進(jìn)行飼養(yǎng)試驗，結(jié)果表明，在肉雞日糧中添加中草藥可達(dá)到與抗生素相當(dāng)?shù)男Ч?。劉則學(xué)等[9]發(fā)現(xiàn)，在仔豬日糧中添加5%的植物提取物綠原酸同樣具有良好的抗腹瀉和改善生產(chǎn)性能的作用，與抗生素效果相當(dāng)。李成洪等[10]提取杜仲、女貞子、黃芪等植物中多糖、齊墩果酸成分0.5%添加于生長豬日糧中，發(fā)現(xiàn)植物提取物和金霉素均有提高生長豬日增重、改善飼料利用效率和降低豬腹瀉的作用，且植物提取物促生長效果和預(yù)防豬腹瀉效果優(yōu)于金霉素。陶新等[11]通過添加不同復(fù)合植物提取物飼喂斷奶仔豬，發(fā)現(xiàn)0.10%的復(fù)合植物提取物可替代飼用抗生素（金霉素+黃霉素），提高仔豬的生長性能，且具有抗應(yīng)激和抗氧化功能。

苧麻是蕁麻科苧麻屬的多年生宿根型草本植物[12]，其綠原酸含量雖然比金銀花、杜仲、蒲公英偏低，但是，Blasco 等[13]發(fā)現(xiàn)，在熱帶地區(qū)飼料用的苧麻每年可以收獲14 次，鮮莖葉產(chǎn)量可達(dá)300 t/hm2，且我國是世界上最大的苧麻生產(chǎn)國，種植面積和產(chǎn)量占世界90%以上[14]。Maknev 等[15]研究發(fā)現(xiàn)飼喂苧麻粉的小牛比飼喂苜蓿粉的小牛長得更快，出肉率更高，Cleasby 等[16]通過用苧麻葉喂養(yǎng)山羊和綿羊，發(fā)現(xiàn)苧麻葉是一種很好的補(bǔ)充飼料，Squibb[17]發(fā)現(xiàn)5%的苧麻干粉能夠預(yù)防幼雞疾病的產(chǎn)生，8%的苧麻干粉可使雞血液中的類胡蘿卜素和維生素A 的含量顯著增加；Squibb[18]通過養(yǎng)豬試驗研究植物飼料蛋白質(zhì)利用情況中發(fā)現(xiàn)，相比于黃豆，紫花苜蓿，香蕉葉，苧麻的效果最好；很多研究和生產(chǎn)實踐表明，中草藥替代抗生素效果明顯，但苧麻的草粉替代抗生素效果研究很少見報道。為此，開展5 個高綠原酸飼用苧麻品種葉片、蘿卜根、繁殖根干粉提取液體外抗菌試驗，篩選出殺菌效果最好的苧麻品種及器官，將該品種的苧麻草粉添加到動物飼料中，可以促進(jìn)我國無抗飼料的生產(chǎn)和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試品種與測定材料參試苧麻品種為樂業(yè)灰綠苧、桐木苧麻、湘飼兼纖用苧麻1 號、紅尖麻、蘆竹青。將收獲后的苧麻分器官置于烘箱中，105 ℃殺青，65 ℃烘干至恒重，用小型植物粉碎機(jī)粉碎，過80 目篩備用。測定材料為葉片、蘿卜根、繁殖根干粉。

1.1.2 苧麻干粉綠原酸提取液稱取1 g 苧麻干粉，加入50 mL pH 值為4 的50%乙醇浸泡24 h，40 ℃下超聲波輔助萃取30 min，過濾，洗滌。重復(fù)提取2 次，并合并濾液，110 ℃常壓蒸餾至25 mL（乙醇完全揮發(fā)）。

1.1.3 細(xì)菌種類與抗生素細(xì)菌種類為大腸桿菌、沙門氏菌?？股貫辂}酸金霉素。

1.1.4 試驗儀器超聲波清洗機(jī)，蒸餾裝置，TU-1810 紫外可見分光光度機(jī)，高壓蒸汽滅菌鍋，TGL16離心機(jī)，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同苧麻品種各器官綠原酸含量的測定采用紫外-可見分光光度法測定：制作綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定綠原酸含量。以比較5 個苧麻品種不同器官綠原酸的含量。

1.2.2 不同品種各器官干粉綠原酸提取液體外抑菌試驗采用紫外-可見分光光度法和比濁法進(jìn)行測定，原理是：細(xì)菌菌液的吸光度與其濃度成良好的線性關(guān)系，并且相應(yīng)的菌落計數(shù)結(jié)果穩(wěn)定[19]。（1）普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基制備：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 值至7.2，121 ℃，高壓滅菌20 min；（2）普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基制備：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 值為7.2，121 ℃，高壓滅菌20 min。（3）大腸桿菌與沙門氏菌菌懸液制備：將1 000 mL 的肉湯培養(yǎng)基分裝到10 個高壓滅菌處理過的錐形瓶內(nèi)，5 個接種大腸桿菌，5個接種沙門氏菌，接種后放置于37 ℃、170 r/min 的搖床培養(yǎng)48 h，600 nm 處測定吸光度值在1.1～1.2，放入4 ℃冰箱內(nèi)備用。

（4）不同品種各器官干粉綠原酸提取液對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果：在無菌工作臺上取1 mL 細(xì)菌菌懸液于5 mL 苧麻提取液，3 組重復(fù)，5 mL 50%的乙醇，5 mL 無菌水中，以無菌水作為對照組，放置于37 ℃、170 r/min 的搖床培養(yǎng)48 h，以50%的乙醇菌液為空白，在600 nm 處測定吸光度。

1.2.3 不同品種葉片干粉提取液和金霉素體外抑菌試驗KB-濾紙片法抑菌原理：將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成一種濃度梯度。在藥物擴(kuò)散的同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的測試菌不能生長，而抑菌濃度范圍外的菌株則繼續(xù)生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈。（1）不同品種葉片干粉綠原酸提取液對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果：稱取10 g 過篩后的苧麻葉粉于燒杯中，加入pH 值為4 的50%的乙醇（固液比1 ∶50）浸泡24 h 后，40℃下超聲波輔助萃取30 min，過濾，洗滌，重復(fù)提取2 次，并合并濾液，常壓蒸餾至10 mL（相當(dāng)于生藥1 g/mL），將瓊脂培養(yǎng)基融化，取10 mL 于平板上，待凝固后加入0.1 mL 細(xì)菌菌懸液，三角耙均勻涂抹，用無菌鑷子將6 mm 無菌濾紙片浸泡于提取液中，貼在有菌的平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小，每種提取液3 組重復(fù)；（2）金霉素對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果：配制1 g/mL 的金霉素溶液，取13 支無菌小試管，除第1 支外，每支試管加入3 mL 無菌水，取3 mL 1 g/mL的藥液于第2 支試管中，混勻后取3 mL 于第3 支試管中，以此類推，到第13 支時，棄去3 mL，濾紙片法測量不同濃度抗生素抑菌圈大小，每個濃度的藥敏片3 組重復(fù)，抑菌圈直徑取平均值。試驗分別以0.98、0.49 mg/mL 的金霉素作為抗生素對照組；（3）藥物對細(xì)菌抑制作用標(biāo)準(zhǔn)：無抑菌圈為無敏，抑菌圈直徑10 mm，低度敏感；10 mm ≤抑菌圈直徑≤15 mm,中度敏感；抑菌圈直徑15 mm，高度敏感[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)用Excel 2010 進(jìn)行統(tǒng)計，用SPSS 22.0 軟件的一般線性模型和比較平均值的LSD 法和SNK 法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種各器官綠原酸含量的分析

由圖1 可知，該5 個品種苧麻不同器官綠原酸含量具有差異性，葉片中的綠原酸含量最高，其次是繁殖根，蘿卜根最低。葉片綠原酸含量最高的品種是樂業(yè)灰綠苧，含量達(dá)0.82%，其次是紅尖麻、桐木苧麻，含量在0.46%～0.67%，湘飼纖兼用苧麻1 號和蘆竹青含量最低，僅0.15%～0.19%；蘿卜根中綠原酸含量差異不大，含量在0.10%～0.16%，繁殖根綠原酸含量最高的品種為樂業(yè)灰綠苧，達(dá)0.30%，蘆竹青、紅尖麻和桐木苧麻次之，含量在0.22%～0.27%，湘飼纖兼用苧麻1 號繁殖根綠原酸含量最低，為0.13%。

圖1 苧麻各器官綠原酸含量比較

2.2 不同品種各器官干粉綠原酸提取液的殺菌效果

由表1 可知，添加了苧麻各器官干粉綠原酸提取液的培養(yǎng)液OD600值均比對照組降低，從而苧麻干粉綠原酸提取液具有一定的殺菌效果。其中，添加葉片提取液對大腸桿菌和沙門氏菌濃度影響比蘿卜根和繁殖根的大。

2.2.1 苧麻各器官干粉綠原酸提取液對大腸桿菌OD600值的影響表1 結(jié)果表明，無菌水對照的的大腸桿菌OD600值最高，為0.394。葉片中，樂業(yè)灰綠苧、紅尖麻和桐木苧麻的大腸桿菌OD600值（0.121～0.169）與無菌水對照的差異最明顯（P＜0.05），比無菌水對照下降了57.11%～69.29%，蘆竹青和苧麻1 號（0.234～0.245）也有明顯降低（P＜0.05）；蘿卜根中，樂業(yè)灰綠苧的大腸桿菌OD600值（0.190）與無菌水對照的差異最明顯（P＜0.05），比無菌水對照下降了51.78%，其他品種（0.215～0.298）無菌水對照的差異也顯著（P＜0.05）；繁殖根中，樂業(yè)灰綠苧、紅尖麻的大腸桿菌OD600值（0.243～0.259）與無菌水對照的差異明顯（P＜0.05），比無菌水對照下降了33.50%～38.32%，其他品種與無菌水對照無明顯差異。在同一品種中，抑菌效果的大小順序為葉片＞蘿卜根＞繁殖根（P＜0.05），而各品種的平均抑菌效果差異較小（0.200～0.294）。

表1 苧麻各器官綠原酸提取液對大腸桿菌和沙門氏菌濃度的影響

2.2.2 苧麻各器官干粉綠原酸提取液對沙門氏菌OD600值的影響表1 結(jié)果表明，葉片和繁殖根中，5 個品種的沙門氏菌OD600值均顯著低于無菌水對照（P＜0.05），其中，葉片中的樂業(yè)灰綠苧、紅尖麻和桐木苧麻與無菌水對照差異最明顯，沙門氏菌OD600值下降了62%左右。在同一品種中抑菌效果：葉片＞繁殖根＞蘿卜根（P＜0.05），各品種平均抑菌效果的大小順序為桐木苧麻（0.267）＞樂業(yè)灰綠苧（0.280）＞紅尖麻（0.288）＞蘆竹青（0.317）＞苧麻1 號（0.392）。

2.3 不同品種葉片干粉綠原酸提取液與抗生素的抑菌效果比較

測量不同濃度抗生素對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑，發(fā)現(xiàn)抗生素濃度在31.25～500 mg/mL 對大腸桿菌的抑制效果為高度敏感，在3.91～15.63 mg/mL對大腸桿菌的抑制效果為中度敏感，低于3.91 mg/mL為低度敏感，低于0.98 mg/mL 為無敏；抗生素濃度在7.81～500 mg/mL 對沙門氏菌的抑制效果為高度敏感，在3.91～7.81 mg/mL 區(qū)間的抑制效果為中度敏感，低于3.91 mg/mL 的抑制效果為低度敏感，低于0.49 mg/mL 為無敏。

由表2 可知，將1 g/mL 樂業(yè)灰綠苧、紅尖麻、桐木苧麻的葉片提取液與0.98 mg/mL 的抗生素對大腸桿菌的殺菌效果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，桐木苧麻和樂業(yè)灰綠苧的葉片提取液與0.98 mg/mL 抗生素對大腸桿菌的抑制效果差異不明顯，紅尖麻的葉片提取液與該濃度抗生素差異明顯（P＜0.05）。

表2 苧麻葉片干粉綠原酸提取液對大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果

將1 g/mL 樂業(yè)灰綠苧、紅尖麻、桐木苧麻的葉片提取液與0.49 mg/mL 的抗生素對沙門氏菌的抑菌效果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，桐木苧麻的葉片提取液與0.49 mg/mL 抗生素對沙門氏菌的抑菌效果無明顯差異，而樂業(yè)灰綠苧和紅尖麻與該濃度抗生素差異明顯（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

5 個苧麻品種不同器官綠原酸含量，以葉片最高，其次是繁殖根，蘿卜根最低。葉片綠原酸含量最高的品種是樂業(yè)灰綠苧，為0.82%，其次是紅尖麻，桐木苧麻，為0.4%～0.8%。添加苧麻各器官干粉提取液的培養(yǎng)液OD600值均比對照組低，在同一品種中，葉片提取液對大腸桿菌和沙門氏菌濃度影響最大，差異最明顯（P＜0.05），其OD600值只有0.121～0.245（對照0.394）和0.149～0.263（對照0.402）。1 g/mL 桐木苧麻和樂業(yè)灰綠苧的葉片提取液與0.98 mg/mL 抗生素對大腸桿菌的抑制效果差異不明顯（P＜0.05），相當(dāng)于1 kg 的桐木苧麻或樂業(yè)灰綠苧的葉粉提取液可替代980 mg 的金霉素，這與我國規(guī)定豬飼料中添加1 330 mg/kg 金霉素用于治療疾病的劑量相近。1 g/mL 桐木苧麻的葉片綠原酸提取液與0.49 mg/mL 抗生素對沙門氏菌的抑菌效果無明顯差異，相當(dāng)于1 kg 桐木苧麻的葉粉提取液可替代490 mg 的金霉素，該劑量處于豬飼料中添加330～670 mg/kg 金霉素用于防止疾病的劑量。

試驗選用的抗生素為金霉素，是一種對革蘭氏陽性菌，陰性菌，大型病毒，螺旋體等有抑制作用的四環(huán)素類廣譜抗生素[21]，養(yǎng)殖戶用它來預(yù)防動物疾病和促進(jìn)動物生長[22]。但是，儂天濤[23]在研究中發(fā)現(xiàn)金霉素的使用在豬肉制品和豬糞便中均有殘留，對豬肉的品質(zhì)和土壤微生物造成不利影響。大量研究表明，綠色植物提取物可抑制和殺滅多種致病細(xì)菌，此試驗得到了一致的結(jié)論。但是通過試驗發(fā)現(xiàn)，并非綠原酸濃度越高，抑菌效果越好，這可能與提取液中含有其他天然有效殺菌成分有關(guān)，因為苧麻葉中除了綠原酸以外，還含有多種黃酮類物質(zhì)[24]，Cushnie 等[25]發(fā)現(xiàn)，富含黃酮類物質(zhì)的天然植物對耐抗生素的細(xì)菌具有良好的抑制作用。王賢芳等[26]用添加6%的苧麻草粉混合飼料與普通蛋雞混合飼料飼喂，發(fā)現(xiàn)蛋雞死亡率降低50 %。鄧羅偉等[27]在研究苧麻草粉不同添加水平（添加5%、10%、15%的苧麻草粉于仔豬的日糧中）對仔豬生產(chǎn)性能的影響中發(fā)現(xiàn)取食添加苧麻草粉日糧的仔豬腹瀉率和疾病發(fā)生率都要比取食未添加組低。由此可以看出，苧麻草粉作為飼料添加劑是完全可行的，此試驗僅證明苧麻葉片提取液具有體外抑菌效果，其能否替代動物飼料中的抗生素，還需進(jìn)行飼喂試驗。此試驗采用的萃取劑為pH 值4 的50%乙醇，乙醇本身所具有的殺菌能力，但其具有揮發(fā)性且作用不穩(wěn)定，濃縮藥液過程中，乙醇揮發(fā)較完全，可忽略乙醇對大腸桿菌和沙門氏菌的影響。