腺苷酸活化蛋白激酶通路在老年糖尿病性骨質(zhì)疏松中調(diào)控機(jī)制研究

柳 雯， 殷雪嬌， 王靈納， 陳宏丹， 林德文， 梁榮珍

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570100

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)為中老年常見病，主要表現(xiàn)為骨量減少、骨脆性增加，進(jìn)一步導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。有研究報(bào)道，OP多由骨吸收及骨形成的平衡被打破引起，與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān)[1]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)相關(guān)信號通路作為細(xì)胞內(nèi)傳感器，可通過對核因子kB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor KB ligand，RANKL)的調(diào)控作用促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化及骨生成功能，抑制破骨細(xì)胞生成及功能[2]。骨骼與葡萄糖代謝水平密切相關(guān)，糖尿病患者的骨轉(zhuǎn)化率相對更低，易繼發(fā)糖尿病性骨質(zhì)疏松(diabetic osteoporosis，DOP)[3]。AMPK參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖和分化等。有研究表明，AMPK信號通路對骨代謝有重要的調(diào)控作用，可影響骨代謝活動[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)，高糖水平會抑制破骨細(xì)胞分化生成和骨吸收，通過上調(diào)RANKL表達(dá)，降低骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)表達(dá)對骨分化情況進(jìn)行調(diào)控[5]。有研究證實(shí)，AMPK可抑制破骨細(xì)胞分化生成中的關(guān)鍵信號聯(lián)級，抑制破骨細(xì)胞生成[6]。但現(xiàn)階段研究并未闡明AMPK在葡萄糖水平對成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞分化生成及功能影響中的調(diào)控作用。本研究旨在探討AMPK相關(guān)通路在老年DOP患者中的調(diào)控機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2019年1月至2021年1月海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的157例老年DOP患者作為DOP組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>60歲；(2)符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)符合OP診斷標(biāo)準(zhǔn)，骨密度值低于同性別、同種族健康成人的骨峰值2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(T<-2.5)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)1型糖尿病者；(2)伴糖尿病急性合并癥者；(3)伴惡性腫瘤、肝腎功能異常及影響鈣磷代謝的疾病者；(4)入組前3個(gè)月內(nèi)服用過影響骨代謝的藥物者；(5)因結(jié)締組織病、長期感染等其他因素造成的OP者。另選取同期157例健康體檢者納入健康組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 骨密度測量 兩組采用雙能量X射線骨密度儀(深圳市艾克瑞電氣有限公司)檢測腰椎L2～L4、股骨頸的骨密度。

T值=測量值-參考值(正常人群峰值)/標(biāo)準(zhǔn)偏差

1.2.2 骨代謝指標(biāo) 采集空腹肘靜脈血，3 000 r/min離心15 min后留取血清，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測血清骨特異性堿性磷酸酶(bone alkaline plaosphatase，BALP)、骨鈣素(osteocalcin，OC)、Ⅰ型原膠原N-端前肽(procollagenⅠtype N-terminal peptide，PINP)，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測β-膠原降解產(chǎn)物(β-cterminal telopeptide of typeⅠcollagen，β-CTX)水平。

1.2.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 采集2 ml空腹外周靜脈血，1 500 r/min離心10 min后留取上清液。取15 ml上清液于離心管中，加等體積PBS稀釋，加等體積淋巴細(xì)胞分離液。用滴管將稀釋血液沿管壁加于分離液表面，低溫下2 000 r/min離心20 min。用吸管吸出單個(gè)核細(xì)胞層于離心管中，加3倍體積的PBS液洗滌，1 500 r/min離心10 min后移去上清液，加入PBS液懸浮沉淀。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (1)RNA獲?。河肞BS沖洗外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)，加1 ml的TRizol后混勻，放置10 min使細(xì)胞裂解。每毫升的TRIzol樣品中加0.2 ml氯仿，上下反復(fù)充分混勻15 s，靜置3 min等待分層。置于冷凍離心機(jī)中離心(4℃、1 2000 r/min、15 min)，轉(zhuǎn)移上層至無RNA酶管中，用等體積異丙醇沉淀RNA，混勻后靜置10 min，再次于冷凍離心機(jī)中離心，移去上清液后加75%乙醇清洗RNA沉淀。置于室溫下干燥10 min使RNA變?yōu)榘胪该?。最后?0 μl無RNA酶的焦碳酸二乙酯水吹打使其完全溶解，所得RNA溶液置于-80℃下備用。(2)cDNA合成：配置反應(yīng)體系，將溶液于1 000 r/min下短暫離心使其混勻，70℃下水浴3 min后，冰水浴至溫度在0℃左右時(shí)加逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃下60 min，取出后立即95℃、3 min，所得cDNA于-80℃下備用。(3)以GAPDH作內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)，反應(yīng)體系：cDNA 2 μl、上游和下游引物各0.8 μl、滅菌蒸餾水6.4 μl、SYBR Green Master Mix 10 μl。引物序列：GAPDH上游5′-AGGCCGGTGTGAGTATGTC-3′，下游5′-TGCCTGCTTCACCACCTTGT-3′；AMPK上游5′-TGATGATGAGGVTGTGAA-3′，下游5′-TAGAGGCGAGGTAGAACT-3′；OPG上游5′-GCTGTTCCTACCAAGATTATAC-3′，下游5′-CTACACTCTCTCGGCATTCA-3′；BMP-2上游5′-GAATCAGAACACAAGTCAGT-3′，下游5′-GACCTGCTAATCCTCACA-3′；RANKL上游5′-GCGTACCTACAGACTATC-3′，下游5′-GGACACCTGAATGCTAAT-3′。將反應(yīng)體系混勻并快速離心，反應(yīng)條件：95℃、1 min，之后95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、45 s(40個(gè)循環(huán))，重復(fù)3次取均值，繪制熔解曲線。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象一般資料比較 兩組男性比例、年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DOP組股骨頸骨密度、腰椎骨密度低于健康組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2 兩組研究對象血清指標(biāo)比較 DOP組BALP、OC、PINP低于健康組，血清β-CTX高于健康組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象血清檢測結(jié)果比較

2.3 兩組研究對象mRNA水平比較 DOP組PBMCs中AMPK mRNA、OPG mRNA、BMP-2 mRNA表達(dá)水平低于健康組，RANKL mRNA表達(dá)水平高于健康組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組研究對象mRNA水平比較

2.4 相關(guān)性分析 股骨頸骨密度與PBMCs中AMPK mRNA、OPG mRNA、BMP-2 mRNA均呈正相關(guān)(r值分別為0.296、0.271、0.304，P<0.05)，與RANKL mRNA呈負(fù)相關(guān)(r值為-0.322，P<0.05)。腰椎骨密度與PBMCs中AMPK mRNA、OPG mRNA、BMP-2 mRNA均呈正相關(guān)(r值分別為0.289、0.277、0.313，P<0.05)，與RANKL mRNA呈負(fù)相關(guān)(r值為-0.331，P<0.05)。

3 討論

由于老年人群骨代謝退行性改變，骨骼失養(yǎng)，骨形成減少，易發(fā)生OP。本研究中，DOP患者股骨頸骨密度、腰椎骨密度明顯低于健康者，與既往研究[7]結(jié)果一致。有研究表明，高血糖會引起骨膠原特性改變，骨密度下降，加之代謝紊亂造成骨代謝異常，骨轉(zhuǎn)化率下降，使得老年糖尿病患者成為OP的高發(fā)人群，這也是DOP患者腰椎與股骨頸骨密度大幅降低的主要原因[8]。

人體骨骼中破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞處于動態(tài)平衡是維持骨骼正常強(qiáng)度和彈性的關(guān)鍵，這種動態(tài)平衡一旦被打破，就會導(dǎo)致骨丟失、骨密度下降，繼而形成OP[9]。骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物是骨組織分解與合成的代謝產(chǎn)物，其中BALP、OC、PINP是成骨細(xì)胞活動及骨形成的代謝產(chǎn)物，反映骨形成情況與成骨細(xì)胞活性；而β-CTX是破骨細(xì)胞活動及骨吸收時(shí)的代謝產(chǎn)物，反映骨吸收情況與破骨細(xì)胞活性。本研究結(jié)果顯示，DOP組的血清BALP、OC、PINP低于健康組，血清β-CTX高于健康組，進(jìn)一步說明了骨過度吸收與骨形成下降打破成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的動態(tài)平衡造成的骨代謝異常是引發(fā)DOP及骨密度下降的主要原因之一。

AMPK被證實(shí)參與細(xì)胞的凋亡、增殖和分化，其被激活后會抑制葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌，使存活的胰腺B細(xì)胞減少，成為糖尿病的臨床治療靶點(diǎn)之一[10]。AMPK可通過多種途徑促進(jìn)成骨分化和礦化，增加骨形成[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠敲除AMPK亞基基因后出現(xiàn)骨量下降的情況[12]。但AMPK通路調(diào)控DOP患者骨代謝的相關(guān)分子學(xué)機(jī)制的研究較為缺乏。有研究證實(shí)，OPG、RANKL、BMP-2基因?qū)谴x有明顯影響，其表達(dá)會間接調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞活性，影響骨分化與骨吸收[13]。本研究結(jié)果顯示，DOP組PBMCs中AMPK、OPG、BMP-2的mRNA表達(dá)低于健康組，RANKL mRNA表達(dá)高于健康組，且股骨頸骨密度及腰椎骨密度與PBMCs中AMPK mRNA、OPG mRNA、BMP-2 mRNA均呈顯著正相關(guān)，與RANKL mRNA呈顯著負(fù)相關(guān)，提示DOP患者骨密度的變化可能與AMPK激活后對OPG、RANKL、BMP-2等基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。OP的發(fā)生與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)[14-15]。DOP患者長期處于高血糖狀態(tài)，機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)等促進(jìn)機(jī)體相關(guān)細(xì)胞因子的分泌增加，刺激AMPK表達(dá)下調(diào)，同時(shí)下調(diào)c-Fos及活化T細(xì)胞核因子c1的表達(dá)，促進(jìn)RANKL表達(dá)上調(diào)與OPG表達(dá)下調(diào)，使OPG-RANKL體系失衡，促進(jìn)RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的活化因子結(jié)合，抑制成骨細(xì)胞分化成熟。有研究證實(shí)，高糖水平會刺激增加RANKL表達(dá)上調(diào)、OPG下調(diào)，從而影響成骨分化[16]，與本研究結(jié)果一致。此外，AMPK表達(dá)下調(diào)會進(jìn)一步抑制BMP-2表達(dá)，形成AMPK/BMP-2信號通路來抑制成骨細(xì)胞的形成與分化。國外研究證實(shí)，AMPK表達(dá)下調(diào)引起的BALP活性降低、BMP-2表達(dá)抑制均可被靶向AMPK的siRNA抑制[17]。也有研究表明，糖尿病通過降低BMP-2表達(dá)來抑制成骨細(xì)胞的增殖及功能[18]。

綜上所述，DOP患者的AMPK表達(dá)明顯下調(diào)，并可通過AMPK/OPG/RANKL及AMPK/BMP-2通路對患者骨代謝進(jìn)行調(diào)控，使骨密度與血清BALP、OC、PINP下降，血清β-CTX升高。