康萊特注射液對淋巴瘤Raji細(xì)胞的殺傷作用

李丹 趙百孝 王建勛 韓麗 胡凱文

摘要 目的：研究不同濃度康萊特注射液（KLT）對人伯基特淋巴瘤Raji細(xì)胞株的增殖抑制與凋亡作用，探討其防治惡性腫瘤的作用機(jī)制。方法：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、CCK-8法等方法觀察12、24、48 h不同時間點KLT對Raji細(xì)胞生長的影響。結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，KLT濃度為1、10、50、100、200 μL/mL作用12 h可引起Raji細(xì)胞凋亡率-0.95%、50.93%、100%、44.39%、-9.94%;CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，KLT濃度為1、10、50 μL/mL作用12 h可引起Raji細(xì)胞生長抑制率為55.41%、25.15%、39.94%，100、200 μL/mL可促進(jìn)細(xì)胞增殖率為122.62%、146.81%;KLT作用24 h后可引起Raji細(xì)胞生長抑制率為32.25%、26.24%、31.61%、129.49%、160.09%;KLT作用48 h后可引起Raji細(xì)胞生長抑制率為91.65%、81.47%、33.74%、103.75%、50.97%。結(jié)論：KLT對Raji細(xì)胞株的生長具有促進(jìn)、抑制雙向調(diào)節(jié)作用，并與作用時間及濃度密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞 康萊特注射液;Raji細(xì)胞;凋亡;流式細(xì)胞術(shù);CCK-8法

Killing Effect of Kanglaite Injection on Lymphoma Raji Cells

LI Dan1，ZHAO Baixiao2，WANG Jianxun3，HAN Li2，HU Kaiwen4

（1 Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China; 3 School of Life Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China; 4 Department of Oncology，Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China）

AbstractObjective： To study the effects of different concentrations of Kanglaite Injection（KLT） on the proliferation and apoptosis of human Burkitt′s lymphoma Raji cells，and to explore the mechanism of KLT in preventing and treating malignant tumors. Methods： Flow cytometry and CCK-8 assay were employed to study the effects of KLT on the growth of Raji cells at the time points of 12，24，and 48 h. Results： The results of flow cytometry showed that the exposure to 1，10，50，100，and 200 μL/mL KLT for 12 h caused the apoptosis rates of -0.95%，50.93%，100%，44.39%，and -9.94%，respectively，in Raji cells.The CCK-8 assay demonstrated that 1，10，and 50 μL/mL KLT treatments for 12 h showed the inhibition rates of 55.41%，25.15%，and 39.94%，respectively，on Raji cells，while 100 μL/mL and 200 μL/mL KLT led to the cell proliferation rates of 122.62% and 146.81%，respectively.The 1，10，50，100，and 200 μL/mL KLT treatments for 24 h led to the inhibition rates of 32.25%，26.24%，31.61%，129.49%，and 160.09%，respectively.The treatments for 48 h caused the inhibition rates of 91.65%，81.47%，33.74%，103.75%，and 50.97%，respectively. Conclusion： KLT has dual regulatory effects on the growth of Raji cells，which is associated with the treatment time and KLT concentration.

Keywords Kanglaite Injection; Raji cells; Apoptosis，F(xiàn)low cytometry; CCK-8

中圖分類號：R248;R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ?doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.016843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

非霍奇金淋巴瘤（Non Hodgkin Lymphoma，NHL）是全球最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，占癌癥診斷和死亡總?cè)藬?shù)近3%，男性患病風(fēng)險高于女性，其發(fā)病率近年來逐漸提高[1-2]?；瘜W(xué)治療是NHL的主要方法，引起的不良反應(yīng)可增加患者生理和心理負(fù)擔(dān)，進(jìn)而產(chǎn)生強(qiáng)烈應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)負(fù)性情緒，影響化療依從性[3]。其中醫(yī)病因病機(jī)涉及濕、痰、毒、瘀、虛，利濕、化痰、解毒、化瘀、扶正是淋巴瘤的重要治法。當(dāng)代腫瘤名家王沛、黃振翹等總結(jié)歷代先賢相關(guān)論述并結(jié)合臨床實踐，將NHL歸為7大類證候：氣滯毒瘀型、寒痰凝滯型、虛火痰結(jié)型、血瘀痰積型、血熱風(fēng)燥型、肝腎陰虛型、氣血兩虧型[4-5]。薏苡仁，其味甘，性微寒，歸脾、胃、肺經(jīng);《神農(nóng)本草經(jīng)》云：“主筋急，拘攣不可屈伸，風(fēng)濕痹，下氣……”現(xiàn)代藥理研究證實，其中含有酯類、脂肪酸、多糖、甾體、三萜及蛋白質(zhì)等化合物逾41種，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、降低血糖濃度及抑制腫瘤生長等作用[6]，是抗癌中藥康萊特注射液（KLT）的主要成分，臨床上并被廣泛應(yīng)用于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌等實體瘤及白血病、淋巴瘤等血液腫瘤的治療[7]。

本研究通過流式細(xì)胞儀觀察不同濃度KLT干預(yù)Raji細(xì)胞12 h后的腫瘤細(xì)胞凋亡率;CCK-8法觀察12 h、24 h、48 h時KLT對Raji細(xì)胞生長情況的影響，立足于為臨床提供KLT治療NHL最適劑量的實驗室依據(jù)，并進(jìn)一步豐富KLT治療NHL學(xué)術(shù)內(nèi)涵。

1材料與方法

1.1細(xì)胞

血液瘤Raji細(xì)胞株（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，貨號：3101HUMTCHu44）。

1.2藥物與試劑

康萊特注射液（浙江康萊特藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10970091）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：WS3-301（Z-038）-2001（Z），均在常溫干燥處保存。RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco，批號：1517016），F(xiàn)BS（Biological Industries，批號：1715752），青-鏈霉素（Caisson Labs，批號：PSL01），CCK-8（北京北仁化學(xué)，批號：20150221）。

1.3主要儀器

離心機(jī)（Eppendorf，德國，型號：5417R），超凈工作臺（哈爾濱市東聯(lián)，型號：FLC-3），倒置顯微鏡（OLYMPUS，日本，型號：CKX41），二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO，日本，型號：MC0175），流式細(xì)胞儀（江蘇貝克曼庫爾特，型號：A00-1-1102），熒光/吸收光酶標(biāo)儀（BioTek，美國，型號：ELx800）。

1.4實驗方法

1.4.1Raji細(xì)胞培養(yǎng)

Raji細(xì)胞（購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）以1×106個/mL接種于含新鮮的RPMI1640培養(yǎng)液（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素及10%胎牛血清）中培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞系處于對數(shù)生長期加入不同濃度KLT進(jìn)行加藥處理。

1.4.2細(xì)胞形態(tài)觀察及流式細(xì)胞儀測定

以1、10、50、100、200 μL/mL的KLT處理5×105個處于對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞12 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）清洗細(xì)胞，用45 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，每孔加入相應(yīng)熒光標(biāo)記抗體5 μL;4 ℃或者室溫避光孵育30 min至1 h，可在搖床上慢搖加速染色，每孔加入PBS清洗，用40 μm濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，進(jìn)行流式檢測。數(shù)據(jù)經(jīng)CellQuest軟件進(jìn)行分析（Becton Dickinson，San Jose，CA，美國）。

1.4.3實驗分組及CCK-8法觀察各組細(xì)胞生長情況

實驗分為空白對照組和1、10、50、100、200 μL/mL不同濃度梯度KLT觀察組。收集對數(shù)生長期Raji細(xì)胞，設(shè)置各濃度細(xì)胞培養(yǎng)基及調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至2×105個/mL，每孔100 μL接種于96孔板，各設(shè)5個復(fù)孔，邊緣孔用0.01 mol/L無菌PBS填充，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱里分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后，在避光條件下統(tǒng)一加入含10%CCK-8無血清培養(yǎng)基100 μL，37 ℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測并記錄光密度（Optical Density，OD）值，計算各觀察組增殖率。

增殖率（%）=（給藥組-空白組）OD值/空白組OD值×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，滿足正態(tài)分布且方差齊的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ?±s ）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗，以 P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1KLT對Raji細(xì)胞凋亡的影響

位于左下象限（Annexin V-PI-）提示為活細(xì)胞，分布于左上象限（Annexin V-PI+）的為損死或壞傷的細(xì)胞，位于右下象限（Annexin V+PI-）的細(xì)胞提示有早期凋亡，分布于位于右上象限（Annexin V+PI+）則為晚期凋亡的細(xì)胞。

12 h后1、10和50、100、200 μL/mL與空白對照組KLT處理后的Raji細(xì)胞早期凋亡率分別為（8.67±2.00）%、（13.22±2.28）%、（17.51±1.20）%、（11.98±2.82）%、（7.89±2.50）%、（8.27±2.51）%。與空白對照組比較，10 μL Raji細(xì)胞的早期凋亡率增加（ P <0.05），50 μL Raji細(xì)胞的早期凋亡率明顯上升（ P <0.01）。見圖1～2。843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

2.2KLT對Raji細(xì)胞增殖的影響

與空白對照組比較，12、24、48 h的1 μL、10 μL、50 μL組Raji細(xì)胞數(shù)量顯著減少（均 P <0.01），100 μL、200 μL組的Raji細(xì)胞數(shù)量明顯增加;12、24 h后，與50 μL組比較，空白對照組Raji細(xì)胞數(shù)量顯著減少（均 P <0.01），100 μL、200 μL組Raji細(xì)胞數(shù)量明顯增加（均 P <0.01）;48 h后，與50 μL組比較，1 μL、10 μL組與空白對照組Raji細(xì)胞數(shù)量顯著減少（均 P <0.01），100 μL、200 μL組Raji細(xì)胞數(shù)量明顯增加（均 P <0.01）。見表1。

2.3KLT對Raji細(xì)胞增殖率的影響

與空白對照組比較，12、24、48 h的1 μL、10 μL、50 μL組的Raji細(xì)胞增值率為負(fù)值，100 μL、200 μL組的Raji細(xì)胞增殖率為正值，康萊特在1 μL、10 μL、50 μL濃度內(nèi)對Raji細(xì)胞具有抑制作用，100 μL、200 μL濃度對Raji細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，其中，1 μL組的抑制作用與100 μL組的促進(jìn)作用最顯著。見表2。

3討論

前期研究表明，KLT聯(lián)合化療藥物治療腫瘤，具有顯著“增效減毒”效應(yīng)。姚小健[8]將49例老年胃癌隨機(jī)分為2組，對照組22例接受替吉奧聯(lián)合奧沙利鉑化療，觀察組27例在對照組的基礎(chǔ)上給予KLT，結(jié)果對照組有效率為36.4%，疾病控制率為45.5%，遠(yuǎn)低于觀察組的66.7%、77.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）。2組主要不良反應(yīng)均為Ⅰ、Ⅱ度的胃腸道反應(yīng)、肝功能損傷、腎功能損傷、神經(jīng)毒性及骨髓抑制，發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P >0.05）。對照組生命質(zhì)量改善率為36.4%，體質(zhì)量改善率27.3%，遠(yuǎn)低于觀察組的66.7%、59.3%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P <0.05）。對于肺部惡性腫瘤轉(zhuǎn)移腦部患者，譚寶利[9]在旋轉(zhuǎn)式伽馬刀及立體定向全腦放療聯(lián)合KLT治療中，單純放療組的無進(jìn)展生存期（Progression Free Survival，PFS）為10.9個月，而聯(lián)合組的PFS為11.9個月。KLT能減輕晚期鼻咽癌患者放療的不良反應(yīng)，提高患者的生命質(zhì)量。張苗苗[10]收集明確臨床診斷為轉(zhuǎn)移或進(jìn)展期為Ⅲ、Ⅳ期的非小細(xì)胞肺癌患者，隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組50例。觀察組接受KLT聯(lián)合吉西他濱及順鉑化療治療，對照組接受吉西他濱及順鉑化療治療，結(jié)果觀察組的聯(lián)合治療提高了化療療效，并增加了化療患者對疾病的抵抗力，延長了癌癥患者的壽命。楊曉玲[11]對41例晚期惡性腫瘤患者應(yīng)用KLT治療前后的研究發(fā)現(xiàn)，KLT治療后患者體力狀況、進(jìn)食量及體質(zhì)量均較治療前明顯改善;血清白蛋白、前清蛋白及血紅蛋白等指標(biāo)較前升高（均 P <0.05）;T細(xì)胞亞群CD3、CD4及自然殺傷細(xì)胞比例較治療前提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

魏衛(wèi)等[12]在相關(guān)研究中補(bǔ)充了KLT可以顯著改善腫瘤患者胃腸道功能，正如《本草經(jīng)疏》所云“性燥能除濕，味甘能入脾補(bǔ)脾……利腸胃，消水腫令人能食”。謝和平等[13]將64例中晚期原發(fā)性肝癌患者隨機(jī)分為觀察組和對照組。對照組單純接受TACE治療，觀察組在TACE治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用KLT。結(jié)果治療后，對照組的改善程度及上升例數(shù)，卡諾夫斯凱計分評分?jǐn)?shù)值方面均差于觀察組（均 P <0.05）。觀察組完全緩解1例，部分緩解15例，總有效率50.0%;對照組完全緩解0例，部分緩解8例，總有效率25.0%，觀察組總有效率顯著優(yōu)于對照組（ P <0.05）。黃挺等[14]為了觀察KLT與肝動脈結(jié)扎法對大鼠荷瘤脾重與肝癌轉(zhuǎn)移灶的抑制作用，通過接種W256癌肉瘤建立Wistar大鼠肝癌轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)KLT可顯著抑制原發(fā)灶生長與肝癌轉(zhuǎn)移灶形成，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達(dá)是其抗肝轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。實體腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移必須有腫瘤血管形成，其中，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）作為血管形成因子起重大的作用。 莫安薇等[15]收集非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）伴發(fā)惡性胸腔積液患者108例作為研究對象，隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組54例。對照組胸腔注射注射用洛鉑，30 mg/m2溶于5%葡萄糖注射液50 mL。觀察組在對照組基礎(chǔ)上胸腔注射KLT，100 mL/次，1次/d。治療后發(fā)現(xiàn)，2組患者胸水中VEGF和RCAS1（Receptor-binding Cancer Antigen Expressed on SiSo Cells， 一種表達(dá)于SiSo細(xì)胞受體結(jié)合腫瘤抗原）表達(dá)均顯著減低（均 P <0.01），且觀察組胸水中VEGF和RCAS1表達(dá)顯著低于對照組（均 P <0.05）。

前期研究證實，中醫(yī)藥聯(lián)合化療等治療方式可很大程度改善NHL患者的預(yù)后。王孟琦等[16]對336例隨訪期NHL患者的中醫(yī)證型分布、中醫(yī)癥狀特點及證型與臨床檢驗指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)預(yù)后可能較好的是脾虛濕盛證的患者，而痰瘀互結(jié)證、陰虛證、痰濕凝滯證及痰熱內(nèi)蘊(yùn)證的患者，其預(yù)后可能相對較差。劉凱等[17]將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的31例NHL患者隨機(jī)分為觀察組15例和對照組16例。對照組采用CHOP方案化療，觀察組在對照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合六味地黃丸治療，觀察比較2組療效。2組總有效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P >0.05），但Ⅱ/Ⅲ度胃腸道反應(yīng)發(fā)生率觀察組為31.2%，低于對照組的46.7%（ P <0.05）;骨髓抑制發(fā)生率觀察組低于對照組（ P <0.05）; 對照組肝腎毒性發(fā)生率為26.7%，觀察組為12.5%，對照組明顯高于觀察組（ P <0.05）;治觀察組患者在潮熱盜汗、腰膝酸軟、消瘦等改善明顯優(yōu)于對照組（ P <0.05）。陳四明等[18]選取陰虛火旺型NHL患者58例，將其隨機(jī)分為觀察組和對照組，每組29例。對照組接受CHOP化療方案治療，觀察組在對照組的治療方案上給予穴位敷貼聯(lián)合牛角地黃湯治療，試驗結(jié)果提示觀察組能夠顯著減少陰虛火旺型NHL患者化療后的不良反應(yīng)發(fā)生，并提高實體瘤的臨床療效。陳方等[19]將B細(xì)胞NHL患者隨機(jī)分為30例對照組及32例觀察組，對照組給予單純化療治療，觀察組聯(lián)合扶正散結(jié)湯，觀察2組患者治療結(jié)束后的治療效果、不良反應(yīng)及PFS。發(fā)現(xiàn)扶正散結(jié)湯聯(lián)合化療治療B細(xì)胞NHL可明顯減輕化療不良反應(yīng)及延長患者PFS。843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

另外，除實體瘤外，KLT還被廣泛應(yīng)用于白血病、淋巴瘤等血液腫瘤的治療中，但相關(guān)的機(jī)制研究還較少。前期研究中，董慶華等[20]觀察KLT對耐藥人白血病細(xì)胞K562/adr及K562/vcr的作用研究中，發(fā)現(xiàn)KLT能逆轉(zhuǎn)多藥耐藥人白血病細(xì)胞株的耐藥性，并能誘導(dǎo)其凋亡。有研究應(yīng)用細(xì)胞生長曲線、電鏡及流式細(xì)胞儀等觀察了KLT對Raji細(xì)胞生長情況的影響，發(fā)現(xiàn)小劑量KLT即可使Raji細(xì)胞凋亡[21-22]。本研究中獲取的實驗結(jié)果示，KLT中小劑量對Raji細(xì)胞的抑制效果最佳，劑量過高并不能增加其對Raji細(xì)胞的殺傷作用，相反，高濃度KLT對Raji細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。這一實驗結(jié)果，也更好地揭示了中醫(yī)藥的雙向調(diào)節(jié)作用，并為臨床選取最優(yōu)劑量提供了實驗室依據(jù)。我們在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，KLT本身的濃度梯度會對OD值產(chǎn)生影響，二者正相關(guān)。該實驗結(jié)果表明，KLT對Raji細(xì)胞株的生長具有促進(jìn)、抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，并與作用時間及濃度密切相關(guān)。

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（2021-05-09收稿本文編輯：楊覺雄）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFC1711904）;教育部雙一流引導(dǎo)專項師資隊伍建設(shè)項目（1000061020014）作者簡介：李丹（1991.08—），女，博士研究生在讀，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治惡性腫瘤，E-mail：20190941214@bucm.edu.cn通信作者：胡凱文（1964.08—），男，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治惡性腫瘤，E-mail：drkaiwenhu@163.com843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F