子癇前期患者血清和胎盤組織中CXC型趨化因子配體12和人類軟骨糖蛋白-39的表達(dá)及意義

劉雅雯, 趙 群, 鄭皓文, 孔 祥, 宋晶哲

(1. 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 婦產(chǎn)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2. 江蘇省興化市人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 江蘇 興化, 225700;3. 江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 江蘇 連云港, 222000)

子癇前期(PE)屬于妊娠期高血壓疾病，是妊娠期特有的一種并發(fā)癥，發(fā)生率為2%～5%[1-2]。PE可導(dǎo)致孕產(chǎn)婦發(fā)生子癇、肝腎功能衰竭甚至死亡，同時(shí)可引發(fā)早產(chǎn)和胎兒生長(zhǎng)受限等問(wèn)題[3]。PE的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，研究[4]表明，妊娠時(shí)PE患者的血管內(nèi)皮受損和全身炎癥、免疫反應(yīng)可能與發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。BURTONG J等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CXC型趨化因子配體12(CXCL12)具有多種功能，包括趨化、血管生成、血管轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞歸巢和器官發(fā)生等，與血管內(nèi)皮變化關(guān)系密切。人類軟骨糖蛋白-39(YKL-40)參與了細(xì)胞的增殖與活化、血管生成、細(xì)胞凋亡以及炎癥應(yīng)答等過(guò)程[6]。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫組化法(IHC)檢測(cè)正常晚期妊娠孕婦和PE患者血清和胎盤組織中CXCL12和YKL-40的表達(dá)，探討CXCL12、YKL-40與PE發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年8月—2021年7月在江蘇省揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院產(chǎn)科住院分娩的100例孕婦，其中50例正常妊娠孕婦設(shè)為對(duì)照組, 50例PE孕婦設(shè)為PE組, PE診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)(第9版)》[7]。2組孕婦的孕周、孕產(chǎn)次、年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 2組孕婦均未臨產(chǎn)，均無(wú)產(chǎn)科其他合并癥，分娩方式均為剖宮產(chǎn)。排除有感染、免疫性疾病、原發(fā)性高血壓、腎臟疾病的患者; 排除有吸煙、酗酒等不良生活習(xí)慣的患者; 排除有輸血、手術(shù)及外傷史的患者。

1.2 方法

收集孕婦空腹靜脈血, 3 000轉(zhuǎn)/min分離血清。采用ELISA測(cè)定孕婦血中CXCL12和YKL-40濃度，試劑購(gòu)自美國(guó)Life Science公司，按照試劑盒說(shuō)明書操作。采用IHC兩步法對(duì)2組孕婦胎盤組織中CXCL12、YKL-40的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)(具體步驟參照所購(gòu)試劑盒操作說(shuō)明書)。CXC12L、YKL-40一抗的工作濃度均為1∶200, 設(shè)置空白對(duì)照[采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗]。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 ELISA結(jié)果判定: 獲得各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本光密度值(OD值)，再減去空白孔的OD值，而后作圖。選取標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為縱坐標(biāo)，選取OD值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線; 根據(jù)樣品的OD值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)即為樣品的實(shí)際濃度。

1.3.2 IHC結(jié)果判定: 采用染色積分評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)CXCL12、YKL-40蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，在每張切片中隨機(jī)選取10個(gè)視野，在顯微鏡高倍鏡下觀察(放大倍數(shù)400倍)，結(jié)果出現(xiàn)細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色顆粒即為陽(yáng)性染色。根據(jù)每張切片上染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分率綜合分析: 0～1分為(-); 2～3分為(+); 4～5分為(); 5～6分為()。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 2組孕婦一般資料比較

2組孕婦的年齡、孕周、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); PE組收縮壓、舒張壓、24 h尿蛋白定量高于對(duì)照組，新生兒出生體質(zhì)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組孕婦一般資料比較

2.2 2組血清CXCL12、YKL-40水平比較

PE組患者血清CXCL12、YKL-40水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表2。

表2 2組血清CXCL12表達(dá)比較 ng/mL

2.3 2組胎盤組織中CXCL12、YKL-40蛋白表達(dá)比較

IHC發(fā)現(xiàn), CXCL12蛋白主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞, PE組胎盤組織中CXCL12的表達(dá)強(qiáng)度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.367,P<0.05)。見表3。YKL-40蛋白在妊娠階段主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，胞核及間質(zhì)細(xì)胞的胞漿也有少量表達(dá), PE組胎盤組織中YKL-40的表達(dá)強(qiáng)度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.472,P<0.05)。見表4。

表3 2組胎盤組織中CXCL12蛋白表達(dá)水平比較

表4 2組胎盤組織中YKL-40蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

PE是妊娠期特有并發(fā)癥，癥狀主要為高血壓、蛋白尿，嚴(yán)重者可引起子癇，導(dǎo)致多器官功能衰竭，是導(dǎo)致圍產(chǎn)期母嬰死亡的主要原因。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者[3-5, 7]提出了PE病因?qū)W的兩步學(xué)說(shuō): 第一步發(fā)生在妊娠早期，發(fā)育不良的滋養(yǎng)層細(xì)胞導(dǎo)致了胎盤形成不良，引發(fā)胎盤缺血缺氧; 第二步是胎盤缺氧進(jìn)一步加重，包括炎癥因子等許多因子釋放到母體循環(huán)中，導(dǎo)致了母體免疫-炎癥系統(tǒng)失衡和內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而引發(fā)PE臨床癥狀。PE的兩步學(xué)說(shuō)認(rèn)為PE的發(fā)生機(jī)制可能與胎盤血管病變導(dǎo)致缺氧和母體免疫-炎癥系統(tǒng)失衡有關(guān)，正常孕婦體內(nèi)同樣存在輕微炎癥應(yīng)答，但PE孕婦免疫-炎癥系統(tǒng)失衡促使炎癥應(yīng)答被放大，導(dǎo)致PE發(fā)生。目前研究[1-5]發(fā)現(xiàn), PE孕婦較正常妊娠孕婦的趨化因子和炎性因子水平顯著升高，提示在PE的發(fā)生機(jī)制中，血管內(nèi)皮受損和免疫-炎癥系統(tǒng)失衡可能發(fā)揮了作用。

趨化因子包括穩(wěn)態(tài)CXCL12和炎癥趨化因子CXCL9、CXCL10等[8-10]。CXCL12的功能主要是控制細(xì)胞定向移動(dòng)，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與多種功能活動(dòng)如造血干細(xì)胞遷移及歸巢、惡性血液系統(tǒng)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵潤(rùn)等方面都起著重要的作用[8-10]。CXCL12與CXCR4是一對(duì)獨(dú)特的趨化因子受體-配體，其相互作用不僅影響免疫細(xì)胞的活化、遷移、募集等，還參與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程[9]。此外，在血管生成與血管再生方面, CXCL12也發(fā)揮了關(guān)鍵作用[10]。目前普遍認(rèn)為絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞在建立子宮胎盤血液循環(huán)過(guò)程中，通過(guò)侵蝕子宮螺旋小動(dòng)脈產(chǎn)生滋養(yǎng)細(xì)胞淺著床是妊娠期高血壓發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究[11-12]發(fā)現(xiàn), CXCL12在PE患者胎盤中表達(dá)呈陽(yáng)性，且隨著病情嚴(yán)重程度的增加，其表達(dá)也逐步增強(qiáng)。研究[12]發(fā)現(xiàn), CXCL12在胎盤組織中的表達(dá)可能主要在妊娠早期發(fā)揮作用。CXCL12及其受體廣泛存在于胎盤組織和細(xì)胞中, CXCL12通過(guò)多個(gè)過(guò)程干擾母胎界面，如胎盤侵襲和胎盤血管生成，影響胎盤和胎兒形成。研究[13-14]表明, IHC顯示PE胎盤組織中CXCL12上調(diào)可能是代償機(jī)制的結(jié)果。氧氣對(duì)妊娠至關(guān)重要，CXCL12的表達(dá)通常與缺氧環(huán)境有關(guān)，缺氧會(huì)刺激滋養(yǎng)層細(xì)胞而增強(qiáng)CXCL12的表達(dá)[15]。

目前已有研究單獨(dú)對(duì)趨化因子CXCL10、CXCL12在PE的表達(dá)進(jìn)行了分析，但研究結(jié)果[10, 12, 16-17]并不一致。由于PE病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，可能是多種因素在PE早期和中晚期同時(shí)共同作用的結(jié)果，且在PE早期和中晚期的作用機(jī)制也可能不一致。既往研究[16-17]發(fā)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)CXCL12和炎癥趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL12在PE的表達(dá)結(jié)果有所不同, CXCL12可能只在PE早期有變化。但近期研究[18-19]在PE早期發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL12與慢性炎癥和免疫激活有關(guān), CXCL12趨化因子參與PE早期的發(fā)病機(jī)制，并在PE發(fā)生的異常新生血管形成、胚胎發(fā)育和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。PE患者早期趨化因子的變化可能是一種代償現(xiàn)象，當(dāng)促炎趨化因子水平升高后，特別是在妊娠期中晚期，全身炎癥因子水平升高，導(dǎo)致CXCL12失去穩(wěn)定狀態(tài)，與炎癥趨化因子CXCL9、CXCL10等共同參與炎癥免疫反應(yīng)，加重了PE器官病變[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn), PE患者CXCL12水平升高，提示機(jī)體出現(xiàn)趨化因子和促炎免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子增加，如胎盤急性炎癥病變的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及YKL-40等水平升高，進(jìn)一步會(huì)導(dǎo)致母體系統(tǒng)內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)PE病情發(fā)展[20], 這與PE病因?qū)W的兩步學(xué)說(shuō)一致。

在哺乳動(dòng)物中, YKL-40主要由多種炎性相關(guān)細(xì)胞合成和分泌，如巨噬細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。因此，這種蛋白質(zhì)被稱為相關(guān)的急性和慢性炎癥進(jìn)展的生物標(biāo)志物[21-22]。YKL-40在先天免疫系統(tǒng)激活和細(xì)胞外基質(zhì)重塑中發(fā)揮重要作用, YKL-40通過(guò)各種免疫細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等參與免疫和炎癥反應(yīng); YKL-40還是一種有效的血管生成因子，特別是在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成中發(fā)揮作用，許多促炎細(xì)胞因子如IL-6、TNF、IL-13和IL-18可以上調(diào)YKL-40表達(dá)，促進(jìn)血管生成和各種炎癥反應(yīng)。DENG Y J等[22]發(fā)現(xiàn)YKL-40可能參與了胎盤的生成和發(fā)育以及人類胚胎干細(xì)胞的分化，但YKL-40在胎盤中的確切作用以及如何參與轉(zhuǎn)化為母體血漿中的YKL-40尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常妊娠孕婦和PE患者的血清和胎盤組織中YKL-40均有表達(dá)，但是PE患者YKL-40的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，推測(cè)PE的發(fā)生發(fā)展與YKL-40的表達(dá)有關(guān)系，這可能與YKL-40參與血管生成和炎癥反應(yīng)有關(guān)。研究[23-24]報(bào)道，炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β可以通過(guò)核因子κB(NF-κB)信號(hào)突進(jìn)誘導(dǎo)YKL-40在軟骨細(xì)胞的表達(dá)和持續(xù)性分泌，在YKL-40的啟動(dòng)子區(qū)域亦含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn), YKL-40的表達(dá)可能受NF-κB的調(diào)控。最新的對(duì)PE病因?qū)W的研究[25]更傾向于母體炎癥系統(tǒng)激活的說(shuō)法，炎癥與PE的關(guān)系甚為密切，易感機(jī)體在內(nèi)在因素和外在因素共同作用之下，激活了NF-κB, 并與YKL-40啟動(dòng)子上的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致YKL-40表達(dá)增加，從而引起體內(nèi)炎癥因子的釋放，從而導(dǎo)致PE患者母體和胎兒發(fā)生一些臨床癥狀，但尚待進(jìn)一步的研究[26]確認(rèn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CXCL12、YKL-40在PE患者中高表達(dá)，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未闡明，只是說(shuō)明PE可能與血管內(nèi)皮受損和炎癥免疫相關(guān)，后續(xù)需要進(jìn)一步監(jiān)測(cè)PE患者不同時(shí)期的血清CXCL12和YKL-40水平變化，這對(duì)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)PE患者病情變化、及時(shí)治療具有一定的意義。