二甲雙胍對多囊卵巢綜合征大鼠胰島素抵抗的影響機制研究

王鳴凱, 張新化, 李 偉, 強 萍

(1. 南通大學附屬醫(yī)院分院 藥劑科, 江蘇 南通, 226001;2. 南通大學醫(yī)學院 人體解剖學系, 江蘇 南通, 226001;3. 江蘇省南通市中醫(yī)院 腎內分泌科, 江蘇 南通, 226001;4. 蘇州大學附屬張家港醫(yī)院 婦產科, 江蘇 蘇州, 215600)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種生殖異常及內分泌紊亂性疾病[1], 主要病理表現(xiàn)之一為胰島素抵抗[2]。近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥是引起PCOS患者發(fā)生胰島素抵抗、卵巢多囊樣改變及激素分泌異常的始動因素。白細胞介素-6(IL-6)是參與炎癥反應的關鍵因子之一，可刺激gp130使信號傳導和轉錄激活因子(STAT)家族成員STAT3活化，介導炎癥活化[4]、降解胰島素受體底物(IRS)表達引起胰島素抵抗的發(fā)生[5]; IL-6/STAT3通路還能通過誘導微小RNA-21(miR-21)轉錄表達介導雄激素的分泌[6-7], 提示調控IL-6/STAT3信號通路表達可能是治療PCOS的潛在機制。二甲雙胍為臨床常用降糖藥，可增強機體對胰島素的敏感性，近年來研究[8]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對PCOS患者的臨床癥狀有一定改善作用，但其具體分子機制尚未闡明。本研究從IL-6/STAT3通路方面探討二甲雙胍治療PCOS的可能機制，以期為二甲雙胍在PCOS領域的推廣應用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與材料

SPF級健康雌性SD大鼠(23日齡)，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，許可證號SCXK(京)2021-0004, 實驗符合3R原則并經蘇州大學附屬張家港醫(yī)院倫理委員會批準，批準文號為IACUC-01(20210007); 脫氫表雄酮(貨號DKO124, 上海滬震實業(yè)有限公司); 二甲雙胍(國藥準字H20080251, 江蘇德源藥業(yè)股份有限公司); STAT3抑制劑Stattic(貨號M00248, 北京百奧萊博科技有限公司); IL-6激活劑IL-6重組蛋白(貨號HY-P7103A, 上海MCE公司); IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號EK-R30201, 上海酶研生物科技有限公司); 胰島素ELISA試劑盒(貨號10-1250-01, 廣州市進德生物科技有限公司); 雄激素-睪酮ELISA試劑盒(貨號SND-R595, 滁州仕諾達生物科技有限公司); 蘇木精-伊紅(HE)染液(貨號BIR615, 北京博爾西科技有限公司); 兔抗大鼠抗體IL-6(貨號ab281935), STAT3(貨號ab68153)，磷酸化STAT3(p-STAT3)(貨號ab76315), 胰島素受體底物-2(IRS-2)(貨號ab76315), 信號轉導途徑抑制蛋白3(SOCS-3)(貨號ab280884), 過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)(貨號ab178866)，均購自美國abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組: 參照文獻[9]方法，于SD大鼠頸背部皮下注射脫氫表雄酮油劑60 mg/kg(大豆油溶解成30 mg/mL油劑，以2 mL/kg給藥體積連續(xù)注射20 d, 1次/d)建立PCOS模型，連續(xù)2個性周期前檢測陰道涂片，若陰道上皮細胞出現(xiàn)角化現(xiàn)象、動情周期不完整，視為造模成功(共50只)，隨機分為模型組、二甲雙胍組、STAT3抑制劑組、IL-6激活劑組、二甲雙胍+IL-6激活劑組，每組10只; 另取10只大鼠于頸背部皮下注射油劑2 mL/kg, 設為假手術組。二甲雙胍組參照文獻[9]方法灌胃給予二甲雙胍270 mg/kg(用生理鹽水溶解成27 mg/mL混懸液, 10 mL/kg給藥體積連續(xù)給藥14 d, 1次/d); STAT3抑制劑組參照文獻[10]經尾靜脈注射STAT3抑制劑Stattic(500 μg/kg, 1次/2 d); IL-6激活劑組參照文獻[11]經尾靜脈注射重組IL-6蛋白(1 μg/kg, 1次/2 d); 二甲雙胍+IL-6激活劑組給予二甲雙胍的同時經尾靜脈注射重組IL-6蛋白進行治療; 模型組及假手術組給予10 mL/kg的生理鹽水灌胃。所有組連續(xù)給藥14 d后，進行后續(xù)試驗。

1.2.2 大鼠胰島素抵抗指數(shù)及雄激素水平檢測: 各組大鼠給藥結束后禁食、禁水12 h, 取腹主動脈血3 mL, 30 000轉/min離心10 min后取血清，應用全自動生化分析儀檢測空腹血糖水平，采用ELISA試劑盒檢測雄激素睪酮、胰島素、血清炎癥因子IL-6水平，計算胰島素抵抗指數(shù)(胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖×胰島素/22.5)。

1.2.3 HE染色法觀察卵巢病理改變: 斷頭處死大鼠，取左右卵巢，右側卵巢置于液氮中保存?zhèn)溆?，左側卵巢?%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋后，制成4 μm厚度切片，取切片行HE染色后于光鏡下觀察。

1.2.4 免疫組化法檢測卵巢組織IL-6陽性表達情況: 取左側卵巢石蠟切片，烘烤脫蠟、梯度乙醇水化、3%過氧化氫封閉及抗原修復處理后，滴加1∶200的IL-6一抗封閉孵育過夜，與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫封閉20 min, 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色及蘇木素復染后，光鏡下觀察拍照，應用圖像處理系統(tǒng)Image Pro plus 6.0檢測單位面積內陽性染色的平均光密度值。

1.2.5 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測卵巢組織miR-21: 取右側冰凍卵巢組織約1 g, 粉碎后勻漿處理，用Trizol試劑盒提取勻漿液中總RNA, 逆轉錄合成單鏈cDNA并以其為模板進行qRT-PCR。反應條件為94 ℃ 110 s(1個循環(huán)), 94 ℃ 20 s、55～60 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s(45個循環(huán)), 72 ℃ 200 s(1個循環(huán))。miR-21上游引物5′-TTGATATGTTGGATGATGGAGT-3′, 下游引物5′-TTACTCCATCATCCAACATATC-3′; 內參基因U6上游引物5′-ACACGACGGCTTCGCTC-3′, 下游引物5′-TGCGTTTAAGCACTTCGCAA-3′。采用2-△△Ct法計算miR-21相對表達量。

1.2.6 蛋白質印跡法(Western blot)檢測卵巢組織蛋白表達: 取剩余右側冰凍卵巢組織，機械粉碎勻漿后得勻漿液，提取勻漿液中蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白總濃度，取60 μg蛋白進行電泳及轉膜反應操作，滴入1∶500的一抗抗體(IL-6、STAT3、p-STAT3、IRS-2、SOCS-3、PPARγ)及1∶700的β-actin內參抗體4 ℃孵育過夜，室溫滴加HRP標記的羊抗兔二抗孵育40 min, 化學發(fā)光法顯色、曝光，使用分析軟件Alpha Ease FC掃描條帶并分析條帶相對灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 二甲雙胍對大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素

抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平的影響模型組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平均高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 二甲雙胍組、STAT3抑制劑組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); IL-6激活劑組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平均高于模型組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 二甲雙胍+IL-6激活劑組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平均高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、睪酮和IL-6水平比較

2.2 二甲雙胍對大鼠卵巢組織病理形態(tài)的影響

假手術組大鼠卵巢組織卵泡及黃體結構正常，無病變; 模型組卵巢組織可見閉鎖卵泡及無卵丘的囊性濾泡增多，卵母細胞放射冠消失，顆粒細胞層減少，黃體萎縮明顯; 二甲雙胍組和STAT3抑制劑組大鼠卵泡逐漸恢復正常，囊性濾泡數(shù)量減少，卵母細胞放射冠逐漸清晰，黃體及顆粒細胞層增多; IL-6激活劑組大鼠囊性卵泡增多，卵巢顆粒細胞層減少，黃體減少及消失嚴重; 二甲雙胍+IL-6激活劑組上述病理損傷較二甲雙胍組嚴重。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織HE染色圖(放大倍數(shù)100倍)

2.3 二甲雙胍對大鼠卵巢組織IL-6陽性表達的影響

假手術組大鼠卵巢組織中IL-6呈弱陽性表達; 模型組大鼠卵巢組織卵泡上皮細胞、顆粒細胞層中IL-6呈強陽性表達, IL-6陽性表達強于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與模型組相比，二甲雙胍組、STAT3抑制劑組大鼠IL-6陽性表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); IL-6激活劑組大鼠IL-6陽性表達高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。二甲雙胍+IL-6激活劑組IL-6陽性表達高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組大鼠卵巢組織IL-6免疫組化染色圖(放大倍數(shù)100倍)

表2 各組大鼠卵巢組織IL-6陽性表達比較

2.4 二甲雙胍對大鼠卵巢組織miR-21表達的影響

模型組大鼠卵巢組織miR-21表達高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 二甲雙胍組、STAT3抑制劑組大鼠miR-21表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); IL-6激活劑組大鼠miR-21表達高于模型組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。二甲雙胍+IL-6激活劑組miR-21表達高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠組織miR-21表達比較

2.5 二甲雙胍對大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、IRS-2、SOCS-3和PPARγ蛋白表達的影響

與假手術組相比，模型組大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表達升高, IRS-2、PPARγ蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，二甲雙胍組和STAT3抑制劑組大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表達降低, IRS-2、PPARγ蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); IL-6激活劑組大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表達高于模型組、二甲雙胍組, IRS-2、PPARγ蛋白表達低于模型組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。二甲雙胍+IL-6激活劑組IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表達高于二甲雙胍組, IRS-2、PPARγ蛋白表達低于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3、表4。

A: 假手術組; B: 模型組; C: 二甲雙胍組; D: STAT3抑制劑組; E: IL-6激活劑組; F: 二甲雙胍+IL-6激活劑組。圖3 各組大鼠卵巢組織IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3、IRS-2和PPARγ蛋白Western blot結果

表4 各組大鼠卵巢組織IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3、IRS-2、PPARγ蛋白表達比較

3 討 論

胰島素抵抗與高雄激素血癥可相互關聯(lián)，促進PCOS發(fā)展。相關研究[12]證實，胰島素分泌過多，一方面可使卵巢間質、卵泡膜細胞、顆粒細胞合成雄激素相關酶的活性升高而大量分泌雄激素，另一方面可干擾肝臟合成性激素結合球蛋白，引起雄激素游離睪酮水平升高。較高水平的雄激素不僅會促進胰島素水平增高，還會促進顆粒細胞迅速黃素化、小竇卵泡發(fā)育停止而影響卵泡的發(fā)育及成熟，導致PCOS患者排卵功能異常[13]。戚懷鉆[14]發(fā)現(xiàn), PCOS患者胰島素抵抗指數(shù)及雄激素水平均顯著高于假手術組，且胰島素抵抗指數(shù)與雄激素水平存在一定相關性。研究[15]發(fā)現(xiàn)，減輕胰島素抵抗，可改善PCOS患者雄激素水平分泌過高，緩解卵巢形態(tài)改變。二甲雙胍可增強組織細胞對胰島素的敏感性，緩解PCOS癥狀。臨床研究[16-17]發(fā)現(xiàn), PCOS患者口服二甲雙胍，可改善子宮內膜形態(tài)，并緩解激素分泌及代謝紊亂，證實了二甲雙胍在治療PCOS方面有潛在應用價值。本研究也發(fā)現(xiàn)，給予PCOS大鼠二甲雙胍治療后，大鼠胰島素抵抗指數(shù)下降，雄激素水平趨于正常，卵巢組織閉鎖卵泡增多、顆粒細胞減少及黃體萎縮等病理損傷緩解，證實二甲雙胍可改善PCOS胰島素抵抗、雄激素分泌增多及卵巢形態(tài)改變等病理癥狀，但其具體作用機制還不甚明確。

炎癥反應可損傷胰島細胞，進而損傷卵巢，導致卵巢囊性改變及激素分泌異常，已受到PCOS研究者的重視[18]。近年來有研究[19]認為PCOS是一種亞臨床炎癥性疾病, PCOS患者血清炎癥因子如IL-6等水平與胰島素抵抗指數(shù)呈正比，并認為炎癥反應是引起PCOS患者胰島素抵抗及雄激素分泌水平升高的始動因素。IL-6/STAT3通路是介導炎癥反應、胰島素抵抗、雄激素分泌增加的關鍵通路。研究[20]證實, IL-6可通過激活Janus激酶，刺激STAT3磷酸化活化，活化的STAT3可引起M2型巨噬細胞特異性因子PPARγ減少而減弱抗炎反應，導致炎癥反應活化。SOCS-3可通過降解IRS-2阻斷胰島素通路過程中的糖原合成及吸收，降低肝臟及組織細胞對胰島素的敏感性，誘導胰島素抵抗的發(fā)生，而IL-6/STAT3活化可增加SOCS-3的表達[21], 提示IL-6/STAT3可通過促進SOCS-3活化來介導胰島素抵抗的發(fā)生。雄激素受體可直接介導miR-21的啟動子區(qū)域而促進miR-21表達, miR-21高表達可促進睪丸去勢大鼠睪丸非依賴性生長[6], 有研究[7]發(fā)現(xiàn)IL-6/STAT3通路活化或抑制能引起miR-21表達的上調或下調，提示IL-6/STAT3通路活化可能通過促進miR-21表達來誘導雌激素分泌。ZHANG Y L等[22]研究發(fā)現(xiàn), PCOS模型大鼠血漿中IL-6/STAT3及miR-21表達均處于活化狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn), IL-6在PCOS大鼠血清及卵巢組織中的表達均異常升高，用IL-6激活劑促進IL-6表達后, STAT3及SOCS-3、miR-21表達也進一步升高，且大鼠胰島素抵抗、雄激素分泌升高及卵巢病理改變進一步加重，反之抑制STAT3活化后, IL-6及SOCS-3、miR-21表達均顯著降低，大鼠胰島素抵抗、雄激素分泌升高及卵巢病理改變均顯著緩解，提示IL-6/STAT3通路活化可能參與PCOS胰島素抵抗、雄激素分泌及卵巢形態(tài)病理改變過程。相關研究[23]報道，二甲雙胍可通過下調IL-6/STAT3通路活化來抵抗卵巢癌細胞惡性增殖，提示二甲雙胍可通過干預IL-6/STAT3通路改善卵巢惡性病變。本研究發(fā)現(xiàn)，采用二甲雙胍治療PCOS大鼠后，大鼠卵巢組織中IL-6/STAT3信號通路處于抑制狀態(tài), IL-6/STAT3信號通路下游與胰島素抵抗、雄激素分泌相關的因子SOCS-3、miR-21表達顯著降低, PPARγ、IRS-2表達顯著升高，提示二甲雙胍治療PCOS可能與抑制IL-6/STAT3信號通路活化有關。本研究還發(fā)現(xiàn), IL-6激活劑可顯著削弱二甲雙胍抑制IL-6/STAT3活化、改善PCOS病理癥狀的作用。

綜上所述，二甲雙胍可通過抑制IL-6/STAT3活化而改善PCOS大鼠胰島素抵抗、雄激素分泌及卵巢形態(tài)改變，為闡明二甲雙胍治療PCOS的具體機制提供了一定參考。但IL-6/STAT3通路參與胰島素抵抗、雄激素分泌的靶基因調控機制還存在許多盲點，未來有待進一步探討。