貓泛白細(xì)胞減少癥病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立

馬 芹， 閆文卓， 周 潔， 高 誠(chéng)， 劉鐵龍， 趙麗麗， 陳洪巖， 陸濤峰

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所， 哈爾濱 100193;2. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心， 上海 201203;3. 河南省濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所， 濟(jì)源 454650)

貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV)，又稱(chēng)貓瘟熱病毒，屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，該病毒為單鏈DNA病毒，基因組全長(zhǎng)約5 200 nt，編碼VP1、VP2 兩種結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP2蛋白為主要衣殼蛋白， 是FPV的主要免疫保護(hù)性抗原蛋白[1，2]。FPV感染范圍較廣，可感染貓科、鼬科及浣熊科動(dòng)物，如貓、獅、虎、豹等[3]; 該病毒傳播較快，可通過(guò)感染動(dòng)物的糞便、尿液及嘔吐物進(jìn)行水平傳播， 妊娠母貓可垂直傳播給胎兒。FPV致病性較強(qiáng)， 可導(dǎo)致妊娠母貓流產(chǎn)或產(chǎn)畸形胎，死亡率高且無(wú)任何病前征兆[4]。目前該病的檢測(cè)主要依賴于病毒分離及血清學(xué)診斷，這些方法耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，不適用于臨床樣品的快速檢測(cè)。隨著動(dòng)物園貓科動(dòng)物、寵物貓的養(yǎng)殖量增多，同時(shí)，許多醫(yī)藥研究也需要實(shí)驗(yàn)用貓，對(duì)貓的疫病監(jiān)測(cè)及防控需高度重視，建立一種適于臨床檢測(cè)FPV的快速檢測(cè)方法迫在眉睫。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification， LAMP)技術(shù)是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)依賴具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，利用4條特異性引物在等溫條件下擴(kuò)增出LAMP特有的梯狀條帶[5，6]。LAMP技術(shù)特異性好、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單，已在禽流感病毒[7]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒[8]、豬細(xì)小病毒[9]及豬流行性腹瀉病毒[10]等方面成功建立了快速檢測(cè)方法。本研究旨在利用LAMP技術(shù)建立一種檢測(cè)FPV的高效、快速、特異性的檢測(cè)方法，用于FPV的早期診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與樣品 FPV，貓皰疹病毒(FHV)，犬細(xì)小病毒(canine parvovirus， CPV)及犬腺病毒(canine adenovirus， CAV)由本實(shí)驗(yàn)室保存; 疑似FPV感染貓臨床樣品來(lái)自上海貓養(yǎng)殖基地。

1.1.2 主要儀器和試劑 EasyPure Viral DNA/RNA Kit、2×EasyTap SuperMix 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司， AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 購(gòu)自美國(guó)Axygen公司， pMD18-T載體購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司，朗報(bào)?脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒和熒光目視檢測(cè)試劑盒購(gòu)自榮研生物科技有限公司，K-8D型電熱恒溫水槽購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)有限公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，其他常規(guī)試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上FPV的VP2基因保守序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，序列為FPV- F： 5'-TGTAACACCTTGGTCATT-3';FPV- R： 5'- ATTCATCACCTGTTCTTA-3'，目的片段為467 bp，用于PCR擴(kuò)增。同時(shí)，利用 PrimerExplore V4 軟件(http：//primerexplorer.jp/e/)針對(duì)PCR擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)LAMP擴(kuò)增引物，序列為F3： 5'-TGCATCATTGATGGTTGC-3'; B3： 5'-AGTAAGTGTACTGGCACAG-3'; FIP： 5'-GGTTGGTTTCCATGGATAAAAACCTATGCCATTTACTCCAGCAG-3'; BIP： 5'-CATCTCATACTGGAACTAGTGGCATGAACATC ATCTGGATCTGTAC-3'，引物均由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 病毒DNA的提取 FPV， FHV， CPV， CAV按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及陽(yáng)性質(zhì)粒構(gòu)建 構(gòu)建PCR擴(kuò)增體系 50 μL： SuperMix 25 μL，模板 2 μL， 引物 FPV- F和引物 FPV- R(10 μmol/L)各 1 μL，重蒸 H2O 補(bǔ)足50 μL。94 ℃ 預(yù)變性 5 min; 94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，35 個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序分析以驗(yàn)證擴(kuò)增片段是否正確。切膠回收PCR產(chǎn)物，連接pMD18-T載體，構(gòu)建陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

1.2.4 LAMP檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化 以提取的FPV DNA為模板，利用引物F3、B3、FIP及BIP按照LAMP試劑盒和熒光目視檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)構(gòu)建LAMP反應(yīng)體系，設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，在恒溫水浴條件下進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)化LAMP反應(yīng)溫度，分別為60℃，63℃，64℃，65℃; 同時(shí)優(yōu)化LAMP反應(yīng)時(shí)間，設(shè)置為30 min，45 min，60 min，反應(yīng)結(jié)束后，可直接目測(cè)結(jié)果，陰性樣品為橘黃色，陽(yáng)性樣品為熒光綠色，或擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳在凝膠成像系統(tǒng)下分析結(jié)果。

1.2.5 LAMP的敏感性檢測(cè) 利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定構(gòu)建的陽(yáng)性重組質(zhì)粒濃度，換算成病毒拷貝數(shù)。將質(zhì)粒10倍系列稀釋進(jìn)行PCR和LAMP敏感性檢測(cè)，比較兩種方法的敏感性。

1.2.6 LAMP的特異性檢測(cè) 以構(gòu)建的最佳LAMP反應(yīng)條件對(duì)FPV、FHV、CPV及CAV進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物直接目測(cè)或經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 將來(lái)自上海的10份疑似FPV感染貓全血樣品，5 000×g離心3 min，取血清，按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組，利用本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP方法和PCR方法進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果比較分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增退火溫度的優(yōu)化， 顯示在46 ℃，48℃，50℃，52℃，54℃，56℃下均可擴(kuò)增出單一條帶(圖1)，初步確定最佳退火溫度為56℃并進(jìn)行下一步試驗(yàn)。擴(kuò)增片段經(jīng)克隆測(cè)序分析，結(jié)果表明擴(kuò)增得到的片段為FPV VP2基因。

2.2 LAMP擴(kuò)增條件的優(yōu)化

圖1 PCR擴(kuò)增退火溫度優(yōu)化Figure 1 Annealing temperature optimization of FPV PCR

通過(guò)設(shè)置不同反應(yīng)溫度，優(yōu)化LAMP擴(kuò)增條件，結(jié)果表明，在60℃、63℃、64℃和65℃恒定水溫下均能擴(kuò)增出典型的“梯形”條帶，陽(yáng)性對(duì)照也呈“梯形”條帶，陰性對(duì)照未擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明LAMP反應(yīng)體系成立。其中，當(dāng)反應(yīng)溫度為65 ℃，條帶最清晰(圖2)，因此確定最佳的LAMP反應(yīng)溫度為65℃。

通過(guò)設(shè)置不同的反應(yīng)時(shí)間，優(yōu)化LAMP擴(kuò)增條件，結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間在30 min，45 min和60 min條件下也均可擴(kuò)增出典型“梯形”條帶。其中， 當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)，條帶最清晰(圖2)，因此確定最佳的LAMP反應(yīng)反應(yīng)時(shí)間為60 min。

圖2 LAMP擴(kuò)增條件的優(yōu)化Figure 2 Optimization of the FPV LAMP

2.3 LAMP的敏感性檢測(cè)

結(jié)果表明，原始陽(yáng)性質(zhì)粒的拷貝數(shù)為5.01×1010拷貝/μL。分別以10倍系列稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒作為L(zhǎng)AMP和PCR擴(kuò)增模板， 擴(kuò)增結(jié)果顯示， LAMP檢測(cè)的最低拷貝數(shù)為5.01×102拷貝/μL(圖3A)，而PCR最低檢測(cè)拷貝數(shù)為5.01×103拷貝/μL(圖3B)，表明LAMP檢測(cè)方法的敏感性比PCR方法高10倍。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用熒光目視檢測(cè)試劑盒，因熒光染料含有鈣黃綠素，在LAMP反應(yīng)初期因與錳離子結(jié)合而處于熒光猝滅狀態(tài)，隨著LAMP反應(yīng)的進(jìn)行，鈣黃綠素逐漸恢復(fù)游離發(fā)出熒光，可實(shí)時(shí)地進(jìn)行肉眼觀察或?qū)U(kuò)增產(chǎn)物置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，均可明顯區(qū)分陽(yáng)性和陰性，目測(cè)時(shí)陽(yáng)性呈綠色，陰性為橘黃色; 在凝膠成像系統(tǒng)下，陽(yáng)性有明亮的熒光，陰性為透明色或較淺的顏色(圖3C)。

2.4 LAMP的特異性檢測(cè)

圖3 PCR和LAMP敏感性分析Figure 3 Sensitive analyze of PCR and LAMP assays

選擇臨床上貓易感的4種病毒FPV、FHV、CAV及CPV進(jìn)行特異性檢測(cè)。以提取FPV、FHV、CAV、CPV的DNA為模板，分別配制LAMP反應(yīng)體系，在65℃反應(yīng)60 min，對(duì)LAMP反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，只有FPV的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)特異的階梯狀條帶，其它模板未擴(kuò)增出條帶(圖4A)，加入熒光染料后，可觀察到FPV的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物顯現(xiàn)明亮的熒光，而其它樣品為透明色或較淺的顏色，為陰性(圖4B)。

2.5 臨床樣品檢測(cè)

采集10份疑似FPV感染貓血清臨床樣品，提取DNA樣品，利用本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP和PCR檢測(cè)方法同時(shí)對(duì)10份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示LAMP檢出3份陽(yáng)性，PCR檢出3份陽(yáng)性(圖5)，兩種方法陽(yáng)性符合率100%。

圖4 LAMP特異性分析Figure 4 Special analyze of LAMP assays

圖5 PCR和LAMP臨床樣品檢測(cè)Figure 5 Evaluation of PCR and LAMP assays with clinical samples

3 討論

貓泛白細(xì)胞減少癥是由FPV引起的一種急性、高度接觸性、致死性傳染病，主要發(fā)生在幼齡貓科動(dòng)物，以高熱、嘔吐為主要特征[11]。近年來(lái)，貓作為寵物，飼養(yǎng)量快速增加，而寵物攜帶的疫病傳播迅速，引起了較多的負(fù)面影響。隨著寵物貓?jiān)诠矆?chǎng)合出現(xiàn)更為頻繁，增加了寵物疫病如貓瘟熱潛在傳播流行的風(fēng)險(xiǎn)。LAMP檢測(cè)方法具有相對(duì)簡(jiǎn)便、快捷、特異、靈敏度高及肉眼觀察等優(yōu)點(diǎn)， 在臨床獸醫(yī)方面有巨大的潛力。從Notomi等[5]研發(fā)LAMP技術(shù)，到Nagamine等[12]在LAMP方法中補(bǔ)充2條環(huán)狀引物，提高了反應(yīng)速度，縮短了反應(yīng)時(shí)間，在60～65 ℃等溫條件下水浴加熱60 min可完成目的基因的擴(kuò)增，使得LAMP技術(shù)已被應(yīng)用于各種病原體的早期檢測(cè)。LAMP的反應(yīng)過(guò)程為先由外側(cè)引物擴(kuò)增出一段模板，再由內(nèi)側(cè)引物與模板互補(bǔ)擴(kuò)增靶基因片段，由于靶基因序列與內(nèi)側(cè)引物存在反向互補(bǔ)序列，通過(guò)雜交形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)過(guò)反復(fù)循環(huán)擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)不等大小的梯形擴(kuò)增產(chǎn)物[13]。

本研究通過(guò)對(duì)LAMP反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化，確定了最佳的反應(yīng)條件，在65℃恒定水浴條件下反應(yīng)60 min后，80℃ 10 min將酶失活，終止反應(yīng)，可直接目測(cè)顏色反應(yīng)，也可經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，表明擴(kuò)增條帶較為明亮和清晰，并且建立的LAMP檢測(cè)方法，可成功檢測(cè)到FPV，而FHV、CPV和CAV為陰性，該方法特異性較好。LAMP檢測(cè)的靈敏度達(dá)到5.01×102拷貝/μL， 比常規(guī)PCR的敏感性高10倍。與PCR擴(kuò)增相比，LAMP方法具有以下優(yōu)點(diǎn)： (1)不需要設(shè)置一系列溫度，只需要設(shè)置一個(gè)反應(yīng)溫度和一個(gè)終止溫度; (2)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較低，恒溫水浴鍋即可滿足; (3)普通PCR方法檢測(cè)至少需要2～3 h，LAMP檢測(cè)只需要1 h可得到檢測(cè)結(jié)果，能在更短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)FPV的檢測(cè); (4)借助熒光染料，可目測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。但需要注意的是，LAMP反應(yīng)是非常靈敏的反應(yīng)，即使混入極其微量的擴(kuò)增產(chǎn)物DNA也有可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的測(cè)定結(jié)果， 為避免這樣的污染， 試劑配制和加樣需在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行， 必要時(shí)， 試劑配制和反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物的電泳分析在兩個(gè)單獨(dú)的房間進(jìn)行操作。

目前， 已有多種針對(duì)貓細(xì)小病毒的疫苗可以用于該病的防控， 但針對(duì)該病的抗原抗體檢測(cè)， 一直沒(méi)有商品化試劑盒， 嚴(yán)重制約實(shí)驗(yàn)貓的質(zhì)量提高。由于對(duì)該病已普遍采取疫苗免疫，且沒(méi)有開(kāi)發(fā)出能區(qū)分疫苗株和野毒株抗體的血清學(xué)方法，因此血清學(xué)診斷的意義有限。雖然已有多篇關(guān)于FPV病毒核酸的PCR檢測(cè)方法報(bào)道[14-16]，但LAMP方法還未見(jiàn)報(bào)道。該方法與PCR方法均以可能含有病毒核酸的病料樣品為檢測(cè)對(duì)象， 如糞便、血清、腸黏膜、心臟、肺臟等組織， 具有廣泛的適用性， 且該方法更加靈敏、簡(jiǎn)便。因此， 本研究建立的LAMP方法可為FPV的核酸診斷提供一種靈敏、簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法， 非常適用于FPV的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。