子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型研究進展

紀 蓮， 馬 鐵， 劉冬妍

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院1. 實驗研究中心， 2. 病理科， 沈陽 110004)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)，簡稱內(nèi)異癥，是一種常見的婦科疾病。其發(fā)病率高達10%～15%，復發(fā)率也很高，并有逐漸增加的趨勢且存有一定的惡變率[1]。盡管該病的研究歷程很長，但其發(fā)病機制還不清楚、治療手段有限。由于倫理道德的原因，很難對患病婦女進行全程觀察，也不能反復進行創(chuàng)傷性、侵襲性或?qū)φ招詫嶒炑芯?。因此，動物模型成為研究該病的重要手段。目前，國?nèi)外已建立靈長類、家兔、鼠類、巴馬香豬、雞胚囊尿膜等多種EMs動物模型[2]。本文就EMs的發(fā)病機制、大鼠模型的建模方法、優(yōu)化措施、評價標準以及模型應用等進行綜合闡述和比較，研究者可根據(jù)實驗需要選擇合適的建模方法，使其更加貼合實驗及臨床研究的需要。

1 發(fā)病原因、發(fā)病機制

目前公認的EMs的發(fā)病機制主要有：經(jīng)血逆流的種植學說[3]，即月經(jīng)周期中脫落的子宮內(nèi)膜碎片經(jīng)過輸卵管倒流至盆腔，在腹膜或者器官表面種植; 全能細胞化生學說，即認為EMs的發(fā)生是子宮內(nèi)膜干細胞和骨髓干細胞的異常增生、分化所致;血管形成和神經(jīng)因素[4]，是EMs發(fā)生的基本條件，“3A”程序，即脫落的子宮內(nèi)膜經(jīng)過黏附、侵襲后，異位內(nèi)膜及其周圍組織形成新的血供。此外還與激素影響、遺傳因素、免疫因素與炎癥、環(huán)境因素等[5]有關(guān)。因此，建立成熟和適合的動物模型對于研究EMs的發(fā)病機制和治療手段十分重要。

2 建模原理及動物選擇

目前，EMs動物模型的制作主要基于“經(jīng)血逆流種植學說”，常見的造模方法有： 自發(fā)型、種植型和誘發(fā)型三種[6]。①自發(fā)型動物模型： 選擇自然發(fā)生EMs的動物作為模型。如： 獼猴、南美狒狒等非人靈長類動物，是公認的最為理想的EMs動物模型。②種植型動物模型(異體移植)： 將人子宮內(nèi)膜或EMs病灶種植到免疫缺陷動物體內(nèi)，任其生長并保持原有形態(tài)。多見于： SCID小鼠、裸小鼠、雌孕激素受體基因敲出小鼠和雞胚尿囊膜等。③誘發(fā)型動物模型(自體移植)： 通過外科手術(shù)方法，直接將自體子宮內(nèi)膜種植到子宮腔外的部位，或者通過手術(shù)閉鎖其子宮頸或陰道口，人為造成經(jīng)血逆流人腹腔而誘發(fā)疾病。多見于： 猴、家兔、大鼠、巴馬香豬等。誘發(fā)型動物模型優(yōu)缺點比較見表1。

大鼠的子宮內(nèi)膜因有著與人類相似的不同分泌時期、動情周期短、全年多次發(fā)情、性成熟早、繁殖力強以及其黃體期比人類要短，可用于EMs對妊娠、排卵、粘連形成、黃體功能缺陷及自身免疫等方面影響的研究。尤其是雌性大鼠對性激素感受性高，性周期規(guī)律，對移植物的成活以及周期變化有很大益處，還可用于研究藥物或其它因素對EMs的作用，成為近些年EMs研究熱門的動物模型。但由于大鼠為自發(fā)性排卵， 不發(fā)生子宮內(nèi)膜脫落，故只可用于建立誘發(fā)型EMs模型。同時，大鼠因其價格低廉，成活率較高，能夠建立與人類EMs相似的病灶，已成為誘發(fā)型首選動物模型[7]。有報道[2]認為： 與Wistar大鼠比較，SD大鼠對性激素敏感，適應性和抗病能力強，更有利于移植的成活及生長，從而建模成功率高于Wistar大鼠。

表1 誘發(fā)型動物模型常用動物優(yōu)缺點比較

3 建模方法與優(yōu)化措施

3.1 術(shù)前

選取有規(guī)律動情周期的雌性動物進行建模。常用的方法有： 陰道脫落細胞涂片檢查或外源性給予一定量的雌性激素。大鼠在動情期， 子宮充血水腫、內(nèi)膜較厚， 適合建模。但在動情期建模， 需要選擇動情期動物分批或逐個手術(shù)，會延長整體實驗的造模時間，而手術(shù)時間的不均一，導致成模、給藥、觀察、取材等一系列的不均一性，增加了實驗的影響因素，也造成實驗周期的延長。肖成明[8]等在EMs建模中各個不同階段給予雌激素，證實在術(shù)前、術(shù)后均外源性給予雌激素的成模率最高，異位囊腫體積最大。但在成模率上，各組間并無統(tǒng)計學差異，但對異位病灶的體積增大有統(tǒng)計學意義。這與Pereira 等[9]的研究在建模時使用雌激素， 可使異位病灶的濕重和干重顯著增大結(jié)果相符。

3.2 術(shù)式

3.2.1 移植物的選擇 通過手術(shù)方法建立EMs模型，應先選擇合適的移植物，常用移植物可以是子宮組織塊、子宮內(nèi)膜或子宮體。①子宮組織塊移植法[10]： 它是將完整的子宮片段縱行切開后，再切成若干2.0～3.0 mm的小塊，移植到腹腔內(nèi)建立EMs模型; ②子宮內(nèi)膜移植法[11]： 它是將切開的子宮片段的子宮內(nèi)膜層與肌層分離，并剪成5.0 mm×5.0 mm的內(nèi)膜組織塊，只移植內(nèi)膜組織到腹腔;③子宮體翻轉(zhuǎn)法[12]： 將剪開小口的子宮外翻暴露，直接把在位內(nèi)膜四角縫合在血運豐富的腹腔大網(wǎng)膜等組織上。三種移植物的優(yōu)缺點比較見表2。

3.2.2 建模方法 手術(shù)法建立EMs模型常用的方法有： 腹腔或腹壁手術(shù)移植法、皮下放置法、皮下注射法、子宮內(nèi)膜逆流法和宮腔開放法。

腹腔或腹壁手術(shù)縫合法[13]： 在尿道口上約1 cm處切長1.5～2.0 cm的縱行切口進腹，找到子宮。在距離子宮分叉約1.5 cm左右處用1號線結(jié)扎第一道，靠近卵巢端結(jié)扎第二道，截取其間子宮長度1.0 cm左右，結(jié)扎欲截取子宮段的系膜及血管。剪斷中間子宮體。將準備好的移植物，上皮層反對著體壁，縫于子宮分叉處、輸卵管處、腹膜或腹壁等位置。

皮下放置法[14]： 同上方法準備好移植物后，從腹肌與皮下筋膜層間，打一隧道，將內(nèi)膜移植物平整放置于隧道底部，使內(nèi)膜面緊貼腹肌。

表2 不同移植物優(yōu)缺點及適用研究方向

皮下注射法[15]： 將移植物修剪成0.5 mm×0.5 mm大小的內(nèi)膜碎片，用9號頭皮針頭連接1 mL注射器，吸取含移植物碎片的生理鹽水，在盡量遠離腹腔切口處皮下注射。

子宮內(nèi)膜逆流法[16]： 在尿道口上約1 cm處切長1.5～2.0 cm的縱行切口進腹后，在子宮近輸卵管1.0 cm處行0.5 cm縱行切口，用特質(zhì)毛刷搔刮子宮內(nèi)膜8周，腸線縫合切口，用眼科無齒平鉗夾閉子宮下段，將2.0 mL生理鹽水經(jīng)子宮輸卵管注入腹腔，使子宮內(nèi)膜組織逆行入盆腔。

宮腔開放法[12]： 同上方法進腹后，在距離子宮分叉約1.5 cm左右處用1號線結(jié)扎，在其無血管的游離緣處用眼科剪，剪開宮腔全層約1.0 cm左右，小心將其內(nèi)膜面外翻暴露，注意勿損傷其游離緣的大血管，并將開放內(nèi)膜面牽至子宮骶韌帶或大網(wǎng)膜血運豐富處接觸，四角縫合，以能將內(nèi)膜面完全覆蓋包裹為佳。

3.3 術(shù)后

建模完成后，臟器復位，給予少量生理鹽水沖洗，肌肉連續(xù)縫合，表皮間斷縫合。注意保溫，待其蘇醒后，可連續(xù)3 d給予青霉素或頭孢類抗生素，以防感染和術(shù)后黏連[17]。

3.4 優(yōu)化措施

文獻報道[18]大鼠EMs的成模率不盡相同，約67%～97%。一般選擇有連續(xù)2個以上規(guī)律動情周期的動物，在動情期進行手術(shù)，移植物應盡量靠近大血管、緊貼移植部位，手術(shù)過程無菌操作，術(shù)后應用抗生素、激素處理[19，20]均可優(yōu)化EMs模型。李龍衛(wèi)等[21]認為，卵泡排出后，卵巢的創(chuàng)面會有利于逆流的子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細胞種植，基于這一理論，首次采用了“刀劃法”，即選取腹膜及肌層表面有血管分支走行處、用柳葉刀輕輕劃毛后再移植子宮內(nèi)膜，術(shù)中操作注意刀劃不宜過深， 不能切斷血管。其總體建模成功率為93.3%。Kiykac Altinbas等[22]用Wistar大鼠腹壁手術(shù)縫合子宮組織塊，術(shù)后3周成模率為97%。

4 模型評價

4.1 成模標準

肉眼可以觀察到移植處有異位組織體積增大，呈透亮囊狀，內(nèi)部充滿清亮或黃色的積液，其表面被結(jié)締組織覆蓋，表面血管清晰[23]。顯微鏡下可見移植物中包含有子宮內(nèi)膜上皮、固有膜及固有膜的基質(zhì)細胞、腺體樣結(jié)構(gòu)，與正常大鼠的子宮內(nèi)膜相似，只是形態(tài)和數(shù)量略有不同[24]。

4.2 檢查方法

4.2.1 開腹探查 根據(jù)實驗設(shè)計，可在特定時間打開腹腔，直接觀察異物病灶的數(shù)目、大小，生長狀況[25]。

4.2.2 皮下觀察 皮下移植后，可在一定時間后，直接測量或觀察皮下病灶變化情況，多用于藥物療效的連續(xù)觀察。

4.2.3 影像學檢查 核磁共振成像(MR)[26]、核素顯像、超聲[27]都可用于EMs模型的檢查。優(yōu)點： 敏感、實時、無創(chuàng)。可相對較早地觀測到異位病灶，動態(tài)連續(xù)觀察，獲得病灶的影像學圖像信息，有效減小了動物的應激反應，并可直接進行數(shù)據(jù)分析。缺點： 無法區(qū)分不典型的異位病灶， 如： 粘連。費用較高， 應用受限。微型正電子體層掃描(PET)、微型單光子發(fā)射計算機體層掃描(SPECT)、磁共振回聲顯微檢查術(shù)、活體影像系統(tǒng)(IVIS)等分子顯像設(shè)備在動物模型中也有嘗試應用[6]。

4.3 手術(shù)建模優(yōu)缺點比較

常用幾種手術(shù)方法建立EMs模型的優(yōu)缺點詳見表3。

5 模型應用

EMs是一種常見的慢性婦科疾病，其動物模型的應用主要有： 臨床藥物治療、治療方法的探索、生理機制的研究等。

臨床藥物治療， 建議選擇皮下放置法。皮下移植與腹膜移植在建模成功率上差異無統(tǒng)計學意義[29]，但皮下放置法無需縫合子宮內(nèi)膜組織，更符合自然黏附原則，避免縫線的異物刺激而改變EMs病灶周圍的微環(huán)境，并且可連續(xù)觀察病灶的變化，便于操作和測量。EMs對妊娠、排卵、粘連形成、黃體功能缺陷的研究可考慮腹腔或腹壁手術(shù)縫合法或?qū)m腔開放法。采用皮下和腹腔兩種部位同時種植，更能反映病變的過程。

空腔開放法是利用炎癥誘導的腹腔內(nèi)環(huán)境建模，較易發(fā)生粘連或死亡，不利于做后續(xù)的藥物實驗。免疫缺陷動物，飼養(yǎng)條件要求較高，無法用于EMs免疫機制研究，在免疫治療方面研究受限。體型較小的動物也不適合做腹腔鏡手術(shù)治療方面的研究。

表3 手術(shù)方法建立EMs模型優(yōu)缺點比較

6 模型評價與展望

隨著EMs動物模型的建立，對EMs病因、發(fā)病機制的認識有了很大提高，也已研發(fā)出多種治療EMs的藥物和方法。但EMs確切發(fā)病機制仍未完全闡明，藥物也只能在一定程度上對EMs起到治療作用而不能徹底治愈。因此，在未來較長時間內(nèi)，動物模型都將是研究該疾病的重要手段。大鼠因其操作簡單、成模率高、可重復性好、能夠建立與人類EMs相似的病灶，已成為EMs建模的常用動物。但因其與人有較大的種屬差異性，實驗結(jié)果與臨床可能存在不一致的情況。同時，不同于人子宮內(nèi)膜組織自然黏附的規(guī)律，建模過程中手術(shù)操作、縫線等異物刺激也會引起炎癥反應， 而EMs本身是一種慢性炎癥性疾病[30]。因此， 動物模型的完善還有很大空間。如： 建立大鼠基因修飾模型， 大鼠EMs的嚴重程度分級等。大鼠的EMs模型雖然有很多種建模方法， 但都各有不足之處， 選擇條件應以實驗目的和實驗室可行性而異， 權(quán)衡各種模型的利弊， 根據(jù)實際需要， 建立合理的EMs動物模型。