SPF金黃倉(cāng)鼠種群的建立及質(zhì)量控制

張華瓊， 夏 爽， 吳燕茹， 何 凡

(成都生物制品研究所有限責(zé)任公司， 成都 610023)

乙型腦炎(乙腦)活疫苗系用乙腦病毒減毒株(SA14-14-2株)接種原代倉(cāng)鼠腎細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液，加入適宜穩(wěn)定劑凍干制成[1]。生產(chǎn)過(guò)程中使用的毒種、細(xì)胞基質(zhì)、血清和胰酶等動(dòng)物源性原材料的外源因子污染是所有活疫苗生產(chǎn)中普遍關(guān)注的問(wèn)題。世界衛(wèi)生組織(WHO)技術(shù)報(bào)告系列(TRS)現(xiàn)行版TRS980(附錄7)為人用乙腦減毒活疫苗生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供了指南，其中，10～14日齡金黃倉(cāng)鼠作為乙腦活疫苗生產(chǎn)用主要起始原材料，所用動(dòng)物的13種病毒[2]應(yīng)為陰性。為加速我國(guó)生產(chǎn)的人用疫苗得到世界的認(rèn)可，2006年國(guó)藥中生成都公司與美國(guó)適宜衛(wèi)生科技組織(PATH)合作，開(kāi)展乙腦活疫苗預(yù)認(rèn)證工作。其中，建立SPF級(jí)金黃倉(cāng)鼠種群是認(rèn)證工作中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 原有金黃倉(cāng)鼠A種群

本單位金黃倉(cāng)鼠一直用于乙腦減毒活疫苗的生產(chǎn)，并適應(yīng)于SA14-14-2疫苗株的培養(yǎng)。種群最初來(lái)源于北京生物制品研究所，普通級(jí)，封閉群;2003年首次通過(guò)剖宮產(chǎn)手術(shù)凈化，自建SPF金黃倉(cāng)鼠種群(A)，以降低疫苗外源因子污染的風(fēng)險(xiǎn)。A種群于屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，常年保持4 000只繁殖母鼠，為乙腦疫苗生產(chǎn)提供10～14日齡動(dòng)物。本研究隨機(jī)選取20對(duì)40～60日齡A種群金黃倉(cāng)鼠。

1.2 引進(jìn)代乳鼠

根據(jù)動(dòng)物生產(chǎn)的實(shí)際情況，結(jié)合外籍專家的建議，擬定6對(duì)動(dòng)物按照既定的遺傳矩陣配種，以建立新種群(B)。2010年10月從德國(guó)Charles River公司引進(jìn)40～60日齡SPF級(jí)金黃倉(cāng)鼠20只(8只雄性，12只雌性)，于隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。

1.3 配種

2010年11月，代乳鼠先后2周分2批配種，每批6只雌鼠，用作代乳鼠。

本單位原有A種群金黃倉(cāng)鼠20對(duì)分2批先后同步配種，作為供胎鼠，用于剖宮產(chǎn)。

1.4 剖宮產(chǎn)及代乳

檢查受孕情況， 推算預(yù)產(chǎn)期， 一旦代乳鼠分娩，立即檢查原有金黃倉(cāng)鼠，結(jié)合腹部觸診，選擇臨產(chǎn)前母鼠實(shí)施剖宮產(chǎn)手術(shù)，取出仔鼠(定義為F0);同時(shí)淘汰代乳鼠的幼崽，將F0轉(zhuǎn)移到代乳鼠籠盒內(nèi)。因?yàn)榇槭笾挥?只先后妊娠，2010年12月，先后實(shí)施剖宮產(chǎn)手術(shù)一共代乳7窩(表1)。

1.5 傳代

F0離乳后雌雄分別飼養(yǎng)，2個(gè)月后從2#～7#代乳鼠后代各挑選2對(duì)， 分別以A、C、E、G、I、K 表示F0(♀)遺傳信息， 以L、B、D、F、H、J分別表示F0(♂)的遺傳信息(表1)， 按照既定的方式進(jìn)行配種， 6 對(duì) /組， 共兩組(1 組備用)， 生產(chǎn)出F1， 以此類推， 經(jīng)過(guò)6次傳代配種，F(xiàn)6具備全部6對(duì)動(dòng)物(F0)的遺傳信息(A～L)。具體配種方式見(jiàn)圖1。

表1 金黃倉(cāng)鼠的剖宮產(chǎn)和代乳情況Table 1 Caesarean and foster nursing in golden hamster 只

圖1 配種矩陣圖Figure 1 Mating matrix

1.6 擴(kuò)群

自F6起，同窩留單一性別，隨機(jī)交配，于2013年5月建立核心種群(312對(duì))，同時(shí)逐步轉(zhuǎn)種到生產(chǎn)群(屏障環(huán)境)，并于2014年7月全部替換原有A種群持續(xù)供應(yīng)乙腦活疫苗生產(chǎn)。

1.7 種群質(zhì)量控制措施

1.7.1 廠房設(shè)計(jì) SPF動(dòng)物生產(chǎn)二車(chē)間(B207)由法國(guó)Technip工程公司按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)和監(jiān)理，建筑面積3 700 m2，專門(mén)用于SPF金黃倉(cāng)鼠生產(chǎn)繁殖。車(chē)間為局部二層結(jié)構(gòu)，二樓為D級(jí)背景，內(nèi)置28臺(tái)隔離器(56個(gè)隔離包)，用于核心群保種，配備UPS，確保不間斷供電。一樓為屏障環(huán)境，有6個(gè)飼養(yǎng)單元(150 m2/單元)，每個(gè)單元擁有獨(dú)立的空調(diào)系統(tǒng)，常年保持4 000只母鼠繁殖，為乙腦疫苗生產(chǎn)提供10～14日齡幼鼠。

1.7.2 人員管理 人員經(jīng)過(guò)充分培訓(xùn)， 持證上崗， 定期體檢， 無(wú)人畜共患病， 人員經(jīng)洗澡、更衣進(jìn)入潔凈區(qū)，隔離器操作戴手套，與動(dòng)物無(wú)直接接觸。

1.7.3 環(huán)境監(jiān)測(cè) 飼養(yǎng)人員每日觀察房間實(shí)際溫濕度壓差情況，中控報(bào)警系統(tǒng)24 h監(jiān)控各項(xiàng)環(huán)境參數(shù)，確保符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。每月檢測(cè)沉降菌，確保清潔消毒效果。

1.7.4 驗(yàn)證校驗(yàn) 定期驗(yàn)證校驗(yàn)， 確保HVAC、隔離器、高壓鍋、各種儀表正常有效運(yùn)行。

1.7.5 維修維保 設(shè)施設(shè)備定期計(jì)劃性維護(hù)保養(yǎng)， 日常故障及時(shí)維修處理。

1.7.6 消毒滅菌 各種物料(籠具、用具、飲水、墊料、飼料)進(jìn)入潔凈區(qū)前都必須經(jīng)過(guò)清潔消毒/高壓滅菌/輻照處理。不同種類消毒劑輪換使用; 消毒滅菌工藝經(jīng)過(guò)驗(yàn)證; 對(duì)飲水、墊料的高壓滅菌效果定期進(jìn)行無(wú)菌檢查; 對(duì)飼料原材料和成品料按要求進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析和無(wú)菌檢查。

1.7.7 3C管理 任何變更(CC)要進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估， 及時(shí)發(fā)現(xiàn)不符合性(N C)，并采取糾正預(yù)防措施(CAPA)。

1.8 動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)

1.8.1 采用哨兵動(dòng)物法監(jiān)測(cè)動(dòng)物種群質(zhì)量 選取4～6周齡雌性倉(cāng)鼠作為哨兵動(dòng)物，每個(gè)隔離包1盒，每盒2～3只，籠盒擱置在離排風(fēng)口較近的地方，在每次更換籠盒時(shí)， 將其臟墊料分散到被監(jiān)控的全部動(dòng)物的干凈籠盒中，確保所有動(dòng)物與哨兵動(dòng)物“100%”接觸，以最大限度地代表整個(gè)群體的質(zhì)量。

1.8.2 本單位QC檢測(cè) 每季度抽取哨兵動(dòng)物，每個(gè)隔離包1～2只，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求采樣，檢測(cè)細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)。

1.8.3 委托檢測(cè) 定期抽取哨兵動(dòng)物，每個(gè)隔離包1只，采集被毛/皮屑、血清、氣管/氣管分泌物、腸道內(nèi)容物等樣品， 每半年國(guó)內(nèi)委托檢測(cè)1次， 每年國(guó)外委托檢測(cè)1次。國(guó)外委托檢測(cè)病毒學(xué)項(xiàng)目19個(gè)，細(xì)菌學(xué)項(xiàng)目16個(gè)，寄生蟲(chóng)學(xué)項(xiàng)目6個(gè)。

2 結(jié)果

2.1 核心群(隔離環(huán)境)

常年保持312對(duì)繁殖倉(cāng)鼠，定期向生產(chǎn)群提供種子。

2.2 生產(chǎn)群(屏障環(huán)境)

常年保持4 000只繁殖母鼠，平均每窩產(chǎn)仔數(shù)11只，年供應(yīng)10～14日齡倉(cāng)鼠16～20萬(wàn)只。

2.3 國(guó)外委托檢測(cè)

病毒學(xué)、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)的檢測(cè)方法及結(jié)果分別見(jiàn)表2，表3和表4。

3 討論

預(yù)認(rèn)證是指WHO通過(guò)對(duì)申請(qǐng)產(chǎn)品的安全性、有效性和免疫效果作出評(píng)價(jià)后，能夠作為國(guó)際機(jī)構(gòu)采購(gòu)疫苗的資質(zhì)確認(rèn)，通過(guò)預(yù)認(rèn)證后，疫苗可以由聯(lián)合國(guó)相關(guān)機(jī)構(gòu)采購(gòu)提供給相關(guān)國(guó)家使用。其主要審核標(biāo)準(zhǔn)是TRS頒布的技術(shù)指導(dǎo)意見(jiàn)，這是世界各國(guó)專家組成員以個(gè)人身份在廣泛的醫(yī)療和公共衛(wèi)生問(wèn)題方面向WHO提供的最新科學(xué)技術(shù)意見(jiàn)，其目的是確保聯(lián)合國(guó)采購(gòu)供應(yīng)疫苗的安全性、有效性和 “100%”的質(zhì)量保證[5]。

為貫徹執(zhí)行《中國(guó)生物制品規(guī)程》( 2000年版) 于生物制品生產(chǎn)和檢定用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須使用清潔級(jí)動(dòng)物的規(guī)定，上海率先進(jìn)行了普通級(jí)金黃倉(cāng)鼠的凈化[6]，本單位于2003年建立SPF金黃倉(cāng)鼠種群(A)， 也是通過(guò)對(duì)普通級(jí)金黃倉(cāng)鼠實(shí)施剖宮產(chǎn)、外購(gòu)SPF金黃倉(cāng)鼠代乳培育而成，微生物凈化級(jí)別符合SPF動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，國(guó)外委托檢測(cè)淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、小鼠肺炎病毒、呼腸孤病毒Ⅲ型、漢坦病毒、小鼠細(xì)小病毒、大鼠K病毒、猴病毒5、小鼠腦脊髓炎病毒、吐蘭病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等11種病毒陰性[7]， 但是多瘤病毒、支原體、分支桿菌等項(xiàng)目[2]也是TRS980的要求， 而且在種群建立時(shí)沒(méi)有進(jìn)行遺傳控制， 也沒(méi)有建立完整的種群資料和記錄。為配合乙腦項(xiàng)目WHO預(yù)認(rèn)證，需要重新建立SPF金黃倉(cāng)鼠種群(B)。

表2 病毒學(xué)檢測(cè)方法及結(jié)果Table 2 Virological items, methods and results

表3 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法及結(jié)果Table 3 Bacteriological items、methods and results

表4 寄生蟲(chóng)學(xué)檢測(cè)方法及結(jié)果Table 4 Parasitological items、methods and results

剖宮產(chǎn)-代乳是常用生物凈化方法之一，一方面要盡早淘汰代乳鼠自己的幼崽， 另一方面， 剖宮產(chǎn)取出的胎兒個(gè)體要足夠大，數(shù)量不宜過(guò)多，以提高成活率。待手術(shù)的孕鼠數(shù)量要充足，如果剖宮取出的胎兒數(shù)量過(guò)多個(gè)體太小，則立即淘汰，另選其它孕鼠再實(shí)施剖宮產(chǎn)，以便選擇較好的胎兒用于代乳。另外，將剖宮產(chǎn)的胎兒與代乳鼠的幼崽接觸一下，可以減少代乳鼠“食仔”情況。

乙腦活疫苗生產(chǎn)使用的是原代倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(PHK)， SPF金黃倉(cāng)鼠的微生物攜帶狀況直接影響產(chǎn)品，其中病毒直接影響疫苗的安全和質(zhì)量， 所以病毒學(xué)項(xiàng)目的篩查尤為重要，新種群排除了19種病毒，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的4種病毒。

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，SPF金黃倉(cāng)鼠需要排除13種細(xì)菌，同時(shí)WHO TRS980還特別要求排除支原體和分支桿菌，其中分支桿菌的檢測(cè)是由本單位QC進(jìn)行的， 主要采集倉(cāng)鼠腎臟和肺臟直接培養(yǎng)，結(jié)果均為陰性。

國(guó)產(chǎn)疫苗國(guó)際化是中國(guó)疫苗界的夢(mèng)想，疫苗生產(chǎn)單位如果要申請(qǐng)預(yù)認(rèn)證，疫苗生產(chǎn)和檢定用動(dòng)物必須符合中國(guó)藥典和WHO TRS980的要求，其中注射用活疫苗生產(chǎn)用金黃倉(cāng)鼠必須至少排除以上13種病毒(表2序號(hào)1-13)，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒，此要求將載入2020年版中國(guó)藥典。

本單位金黃倉(cāng)鼠剖宮產(chǎn)凈化手術(shù)一直選擇原有種群， 外購(gòu)動(dòng)物僅僅用作代乳，一方面是為了確保遺傳背景清楚， 另一方面是不用變更疫苗生產(chǎn)用原材料。本次剖宮產(chǎn)凈化的金黃倉(cāng)鼠B種群已先后送中國(guó)食品藥品檢定研究院和上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行遺傳檢測(cè)，遺傳質(zhì)量分析工作還在進(jìn)行中。