慢肝養(yǎng)陰膠囊對酒精性肝炎大鼠肝組織Caspase-3及PTP1B表達的影響及相關(guān)性研究*

侯麗，韓偉

（1.內(nèi)蒙古巴彥淖爾市醫(yī)院消化科，巴彥淖爾 015000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科，呼和浩特 014030）

酒精性肝病（ALD）是因長期大量飲酒所引起的肝臟疾病[1]。初期表現(xiàn)為脂肪肝，進而可發(fā)展成為酒精性肝炎和酒精性肝硬化，嚴(yán)重酗酒可誘發(fā)廣泛的肝組織細(xì)胞壞死甚至引起肝功能衰竭[2]。慢肝養(yǎng)陰膠囊的處方由北沙參、麥冬、地黃、枸杞子、川楝子、當(dāng)歸、五味子、黨參、桂枝、人參組成，內(nèi)容物為棕色粉末，味微苦。功能主治為養(yǎng)陰清熱，滋補肝腎，用于遷延性肝炎、慢性肝炎、肝炎后綜合癥。研究表明慢肝養(yǎng)陰膠囊對大鼠四氯化碳肝損害具有保護作用[3]，對于抗結(jié)核藥物所致肝損害具有良好的預(yù)防作用[4]。本研究通過實驗觀察慢肝養(yǎng)陰膠囊對酒精性肝炎大鼠模型的影響，為慢肝養(yǎng)陰膠囊在臨床上用于治療酒精性肝炎提供實驗研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠50只，SPF級，雄性，體質(zhì)量 180～220 g，許可證號：SCXK（蒙）2020-0001，購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。實驗大鼠于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號：SYXK（蒙）2020-0003。飼養(yǎng)條件：溫度 20～25℃，濕度40%～50%，自由飲食飲水。飼料經(jīng)輻照消毒處理。

1.2 藥品和試劑 慢肝養(yǎng)陰膠囊，規(guī)格：0.25 g/粒，60粒/盒。用法用量：口服，每次4粒，每日3次。國藥準(zhǔn)字Z52020175，貴州威門藥業(yè)股份有限公司。多烯磷脂酰膽堿膠囊，規(guī)格：228 mg×36粒，每日3次，每次1粒，國藥準(zhǔn)字H20059010，賽諾菲（北京）制藥有限公司。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒，批號：20191219；γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）試劑盒，批號：20200127；超氧化物歧化酶（SOD）批號：20200312；丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫試劑盒，試劑批號：20200119，以上酶聯(lián)免疫試劑盒購于南京建成生物工程研究所?；罨腚装匪岬鞍酌傅鞍?3抗體（Caspase-3）批號：AE031025；蛋白酪氨酸磷酸酶1B抗體（PTP1B）批號：03293306以上抗體均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。TMS-P超敏試劑盒，福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，2002215476b。DAB顯色劑，福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：2003210031B。磷酸緩沖鹽溶液（PBS），北京索萊寶科技有限公司，批號：20200210。

1.3 實驗儀器 貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀。日本島津UV-2700紫外可見分光光度計。MY2300全自動免疫組化染色機。BX43型顯微鏡，奧林巴斯中國有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物模型的建立及分組給藥 大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機分為空白對照組、模型對照組、慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組（0.27 g/kg）、慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組（0.54 g/kg）、多烯磷脂酰膽堿膠囊（西藥陽性藥對照）組（0.15 g/kg），每組10只。除了空白對照組外，其他各組均用50%乙醇造模，灌胃體積為12 mL/kg[5-6]。各給藥組灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，10 mL/kg，空白對照組、模型對照組灌胃等體積的蒸餾水。造模同時給藥16周。隔夜禁食，次日腹腔內(nèi)注射0.3%戊巴比妥鈉溶液按10 mL/kg麻醉，取靜脈血，分離血清，按試劑盒說明操作檢測血清AST、γ-GT。取肝組織1 g勻漿后提取上清液，按試劑盒說明操作檢測肝組織中SOD、MDA的活性。取肝左葉用福爾馬林固定，用于蘇木精-伊紅（HE）染色，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測肝組織細(xì)胞中Caspase-3和PTP1B的表達。

1.4.2 肝臟組織HE染色 肝臟組織病理切片脫蠟至水，首先采用蘇木精染色，再用1%的鹽酸乙醇進行分化，用0.5%的伊紅液復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明液透明處理兩次，最后采用中性樹膠封片，觀察肝臟組織細(xì)胞脂肪變性及炎癥損傷程度。

1.4.3 免疫組化法檢測肝臟組織中Caspase-3和PTP1B的表達 切片脫蠟至水，放入已沸騰的檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中，中檔微波處理10 min，3%H2O2室溫孵育，PBS沖洗3次。10%的山羊血清孵育10 min。然后滴加一抗（Caspase-3抗體稀釋比例為1∶200；PTP1B 抗體稀釋比例為 1∶150），室溫孵育 2 h。PBS緩沖液沖洗。滴加二抗，室溫孵育30 min。磷酸緩沖鹽溶液沖洗。滴加100 μL辣根酶標(biāo)記的鏈霉素工作液，室溫下孵育30 min。磷酸緩沖鹽溶液沖洗。滴加50 μL新鮮配制的DAB顯色劑，4 min后自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片[7-8]。使用Image J軟件檢測圖片光密度值（OD）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢肝養(yǎng)陰膠囊對血液生化指標(biāo)影響 造模同時給藥16周后，模型對照組大鼠的血清AST和γ-GT比空白對照組的血清AST和γ-GT顯著增加（P＜0.01），與模型對照組相比各給藥干預(yù)組血清中的AST和γ-GT比模型對照組顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組與慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組的作用呈劑量依賴性，多烯磷脂酰膽堿膠囊組與慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組作用結(jié)果未見顯著性差異，見表1。

表1 慢肝養(yǎng)陰膠囊對血清中AST、γ-GT活力的影響（±s）Tab.1 Effect of Mangan Yangyin Capsules on the activity of AST and γ -GT in serum（±s）

表1 慢肝養(yǎng)陰膠囊對血清中AST、γ-GT活力的影響（±s）Tab.1 Effect of Mangan Yangyin Capsules on the activity of AST and γ -GT in serum（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) 劑量（g/kg） AST（U/L） γ-GT（U/L）空白對照組 10 - 48.24± 6.07 212.62±28.63模型對照組 10 - 109.73±17.62**278.33±20.74**多烯磷脂酰膽堿膠囊組 10 0.15 77.84±16.04## 234.60±25.62##慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組 10 0.27 95.81±10.18# 250.64±18.39#慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組 10 0.54 81.46±11.19## 233.93±21.89##

2.2 慢肝養(yǎng)陰膠囊對肝組織生化指標(biāo)影響 邊造模邊給藥16周后，模型對照組肝臟中SOD顯著降低（P＜0.01），與模型對照組相比各給藥組肝組織中SOD活性顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。邊造模邊給藥16周后，模型對照組肝臟中MDA顯著增多（P＜0.01），與模型對照組相比各給藥組肝組織中MDA含量顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01），慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組與慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組的作用呈劑量依賴性，多烯磷脂酰膽堿膠囊組與慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組作用結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 慢肝養(yǎng)陰膠囊對肝組織中SOD活性和MDA含量的影響（±s）Tab.2 Effect of Mangan Yangyin Capsules on the content of SOD and MDA in liver tissue（±s）

表2 慢肝養(yǎng)陰膠囊對肝組織中SOD活性和MDA含量的影響（±s）Tab.2 Effect of Mangan Yangyin Capsules on the content of SOD and MDA in liver tissue（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

MDA（nmol/mL）空白對照組 10 - 196.38±12.64 4.62±0.95模型對照組 10 - 149.36±21.71** 11.15±2.39**多烯磷脂酰膽堿膠囊組 10 0.15 167.85±13.01## 7.05±1.34##慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組 10 0.27 163.94±10.02# 9.42±1.18#慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組 10 0.54 171.27±13.62## 7.51±1.31##組別 動物數(shù) 劑量（g/kg）SOD（U/mg）

2.3 慢肝養(yǎng)陰膠囊對肝臟組織脂肪變性的影響 空白對照組肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，胞漿染色均勻，無脂肪變性，未見炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞壞死特征，與空白對照組對比模型對照組大鼠肝索排列紊亂，肝細(xì)胞生腫大，可見有明顯的脂肪空泡和炎細(xì)胞浸潤；經(jīng)16周防治后可見各給藥組存在一定數(shù)量的脂肪空泡，但脂肪空泡和炎細(xì)胞浸潤較模型對照組有一定的減輕，見圖1。

圖1 大鼠肝臟組織HE結(jié)果（×200）Fig.1 HE results of rat liver tissue（×200）

2.4 慢肝養(yǎng)陰膠囊對Caspase-3和PTP-1B在肝臟組織中表達的影響 造模同時給藥16周后，與空白對照組相比模型對照組肝臟組織中Caspase-3和PTP1B表達顯著增加（P<0.01），與模型對照組相比各給藥組肝組織中Caspase-3和PTP1B表達顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01），慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組與慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組的作用呈劑量依賴性，慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組作用優(yōu)于多烯磷脂酰膽堿膠囊組，但結(jié)果見顯著性差異，結(jié)果見表3、圖2和3。

表3 各組肝臟組織中Caspase-3和PTP1B表達（灰度值）的比較（±s）Tab.3 Comparison of Caspase-3 and PTP1B expression(gray value)in liver tissue of each group（±s）

表3 各組肝臟組織中Caspase-3和PTP1B表達（灰度值）的比較（±s）Tab.3 Comparison of Caspase-3 and PTP1B expression(gray value)in liver tissue of each group（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) 劑量（g/kg） Caspase-3 PTP1B空白對照組 10 - 0.075±0.028 0.062±0.024模型對照組 10 - 0.199±0.047** 0.218±0.059**多烯磷脂酰膽堿膠囊組 10 0.15 0.164±0.026## 0.165±0.028##慢肝養(yǎng)陰膠囊低劑量組 10 0.27 0.161±0.034# 0.175±0.033#慢肝養(yǎng)陰膠囊高劑量組 10 0.54 0.155±0.028## 0.153±0.034##

圖2 大鼠肝組織Caspase-3表達的結(jié)果（×200）Fig.2 Results of Caspase-3 expression in rat liver tissue(×200)

圖3 大鼠肝組織PTP1B的結(jié)果（×200）Fig.3 Results of PTP1B expression in rat liver tissue(×200)

2.5 大鼠血清AST活性與肝臟組織中Caspase-3及PTP1B表達相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示大鼠血清中AST的活性與肝臟組織中Caspase-3及PTP1B表達之間具有相關(guān)性（r=0.755，r=0.826，P＜0.01），見表 4。

表4 大鼠血清AST活性與肝臟組織中Caspase-3及PTP1B表達相關(guān)性分析Tab.4 Correlation between serum AST activity and expression of Caspase-3 and PTP1B in liver tissue of rats

2.6 大鼠血清肝臟組織中Caspase-3與PTP1B表達相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示大鼠肝臟組織中Caspase-3與PTP1B表達之間具有相關(guān)性（r=0.696，P＜0.01）。

3 討論

酒精性肝病臨床分為脂肪肝、肝炎、肝硬化，常混合存在[9]。酒精主要在肝臟組織中代謝，經(jīng)過肝臟組織細(xì)胞中的乙醇脫氫酶的催化氧化為乙醛，再經(jīng)過乙醛脫氫酶催化轉(zhuǎn)成乙酸，最終形成二氧化碳[10]。在酒精的氧化過程中分解出大量的氫離子和輔酶結(jié)合，引起依賴還原型輔酶的物質(zhì)代謝發(fā)生了改變，最終成為物質(zhì)代謝紊亂和誘發(fā)疾病的基礎(chǔ)[11]。乙醛還對肝臟組織細(xì)胞具有直接毒性作用，如影響線粒體產(chǎn)生腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、抑制生物合成蛋白質(zhì)和排泌以及引起脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積[12]。一次酗醉幾小時后即可發(fā)生肝脂肪變。酒精性肝炎主要表現(xiàn)為血清AST升高，谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平升高不靈敏是因為乙醛使酶的活性輔因子B6下降所引起的[13]。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶廣泛地分布在人體組織中，腎臟組織中最多，其次是胰腺和肝臟[14]。在肝臟組織中主要分布于胞漿和肝內(nèi)膽管上皮組織中，血液中γ-GT主要來自肝臟組織[15]。嗜酒會引起肝臟損傷致使血清γ-GT活性升高，酒精損傷肝細(xì)胞微粒體時γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶升高較靈敏[16]。本研究結(jié)果表明慢肝養(yǎng)陰膠囊可降低酒精性肝炎大鼠模型血清中AST和γ-GT的活力。

SOD，又稱為肝蛋白，可以消除組織在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，還能夠?qū)购妥钄嘌踝杂苫鶎?xì)胞造成的損害，并能夠及時修復(fù)受損的細(xì)胞，抵抗因為自由基造成的細(xì)胞傷害[17]。MDA是脂質(zhì)氧化代謝的終產(chǎn)物，可以影響線粒體關(guān)鍵酶的活性。氧化應(yīng)激性肝損害在酒精性肝病占有至關(guān)重要的地位，氧化應(yīng)激（OS）是體內(nèi)抗氧化作用與氧化反應(yīng)的失衡狀態(tài)，傾向于氧化反應(yīng)，氧化應(yīng)激能夠引起中性粒細(xì)胞的炎性浸潤和白酶分泌增加，從而產(chǎn)生大量的氧化中間產(chǎn)物[18]。本研究結(jié)果表明慢肝養(yǎng)陰膠囊可升高酒精性肝炎大鼠模型肝組織中SOD的活性，降低酒精性肝炎大鼠模型肝組織中MDA的含量。

酒精性肝病中由于線粒體功能失調(diào)可導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡，Caspase-3活性增加。Caspase-3在細(xì)胞凋亡中具有重要的作用，Caspase-3主要的底物是腺嘌呤核苷二磷酸（ADP）-核糖聚合酶，在細(xì)胞啟動凋亡時，ADP-核糖聚合酶能夠被Caspase-3剪切成85kD和31kD兩個片段，使ADP-核糖聚合酶中與DNA結(jié)合的兩個催化區(qū)域分離，最終使受ADP-核糖聚合酶負(fù)調(diào)控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解了核小體間的DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19-21]。本研究結(jié)果表明慢肝養(yǎng)陰膠囊可降低Caspase-3在酒精性肝炎大鼠模型肝組織中的表達。

PTP1B廣泛存在于肝組織細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌組織細(xì)胞和上皮細(xì)胞多個組織中，PTP1B主要位于胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組織中，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、生長、代謝和基因轉(zhuǎn)錄等[22]。機體PTP1B活性的升高與胰島素抵抗和非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）均密切相關(guān)，通過調(diào)控靶點PTP1B可降低肝臟脂質(zhì)合成、減少三酰甘油在肝細(xì)胞中的堆積，也有研究表明長期大量飲酒可增加胰島素抵抗[23-25]。本研究結(jié)果表明慢肝養(yǎng)陰膠囊可降低PTP1B在酒精性肝炎大鼠模型肝組織中的表達。

本研究結(jié)果表明肝臟組織中Caspase-3與PTP1B表達之間具有相關(guān)性，呈正相關(guān)，說明酒精性肝炎時線粒體調(diào)控能量代謝、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損害等功能的異常和胰島素抵抗共同參與了肝細(xì)胞損傷的病理過程。慢肝養(yǎng)陰膠囊可能通過提高機體的抗氧化能力、減輕胰島素抵抗、抗凋亡等途徑對大量飲酒產(chǎn)生的肝損傷起到保護作用。