豬表皮生長因子的原核表達(dá)及純化

劉 庭，湯慧，唐青海，劉 莎，薛姣雄，吳廣艷，馬潔，趙婷芳，唐斯萍

（衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院南岳山區(qū)生物資源保護(hù)與利用湖南省重點實驗室動物微生物新型檢測技術(shù)及生物制劑衡陽市重點實驗室，湖南 衡陽 421008）

1 引言

研究的重要意義：豬表皮生長因子（porcine epidermal growth factor，pEGF）有利于豬的早期胚胎發(fā)育[1]、能提高母豬的窩產(chǎn)仔數(shù)[2]、提高仔豬成活率[3-4]以及促進(jìn)斷奶仔豬的生長[5]，同時pEGF可作為添加劑增加仔豬斷奶早期細(xì)胞對必須微量元素的吸收[6]、能改善斷奶仔豬生長性能和緩解腹瀉[7]，這在獸醫(yī)臨床研究以及養(yǎng)豬業(yè)具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

前人研究進(jìn)展：表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）由Stanley Cohen在1962年從小鼠下頜腺中分離提純出的一種單鏈多肽類活性物質(zhì)[8]，經(jīng)眾多學(xué)者努力，發(fā)現(xiàn)其家族包括EGF和類EGF因子，它們具有高度相似的結(jié)構(gòu)和功能[9]，分子量為6 kDa，含有53個氨基酸殘基，分子內(nèi)含有3個二硫鍵[10]，其活性中心位于第48～53個氨基酸殘基之間。孫衛(wèi)國等發(fā)現(xiàn)表皮生長因子普遍存在于人、犬和豬等動物體內(nèi)[11-13]，EGF是動物乳中含量最豐富的生長因子之一，在體外和體內(nèi)均能刺激表皮細(xì)胞增殖和角質(zhì)化[14]，同時也是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞有絲分裂原[15]，具有刺激細(xì)胞分裂增殖與分化，促進(jìn)離子交換和細(xì)胞外基質(zhì)合成等生物學(xué)特性[1]，槐玉英等發(fā)現(xiàn)豬表皮生長因子（porcine epidermal growth factor，pEGF）是卵巢和子宮局部重要的調(diào)節(jié)因子，對豬的繁殖性能有一定的影響[5,16]。

研究切入點：人工合成、克隆并表達(dá)pEGF基因，構(gòu)建原核表達(dá)菌株，優(yōu)化表達(dá)條件，通過GSTTag親和層析純化方法提高pEGF的純度。

本研究擬解決的關(guān)鍵問題：提高蛋白表達(dá)量，摸索效果良好的表達(dá)條件及純化工藝。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

原核表達(dá)載體pGEX4T-1均購自美國Novagen公司，細(xì)菌蛋白抽提試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，重組質(zhì)粒PMD18-T Vector-pEGF、IPTG、內(nèi)切酶（BamHI、ECoRI）、考馬斯亮藍(lán)R250和氨芐霉素均購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司，GST-Tag-Mouse MAb和Goat anti-Mouse-IgG均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購自Solarbio公司，GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

2.2 方法

2.2.1 重組質(zhì)粒pGEX-pEGF的構(gòu)建

（1）人工合成pEGF，串聯(lián)順序如下：pEGF全長基因為159bp，編碼53aa，蛋白分子量6 kDa，序列如下：

AATAGTTACTCTGAATGCCCGCCGTCCCACG ACGGGTACTGCCTCCACGGTGGTGTGTGTATGTAT ATTGAAGCCGTCGACAGCTATGCCTGCAACTGTG TTTTTGGCTACGTTGGCGAGCGATGTCAGCACAG AGACTTGAAATGGTGGGAGCTGCGC

以上序列由TaKaRa公司合成，載體為pGEX4T-1，采取GST-pEGF融合表達(dá)，酶切位點：BamHI+pEGF+EcoRI。

（2）對pMD18-TVector-pEGF菌株提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切，對目的基因部分進(jìn)行切膠回收，得到目的基因pEGF片段。將原核表達(dá)載體pGEX4T-1溶液、目的基因DNA溶液和連接液混合均勻，質(zhì)粒載體pGEX4T-1與pEGF基因進(jìn)行聯(lián)結(jié)，得到重組質(zhì)粒pGEX-pEGF，將其轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行核酸電泳鑒定，結(jié)果呈現(xiàn)陽性表示pGEX-pEGF構(gòu)建成功，便將提取出的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosseta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，篩選得到Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF的陽性菌株。

2.2.2 重組表達(dá)菌株Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE電泳檢測

分別對Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF和pGEX4T-1空載的轉(zhuǎn)化菌液Rosseta(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，均按照1∶500的比例將菌液分別接種于兩瓶含有Amp（終濃度為200μg/mL）的4mL LB液體培養(yǎng)基中，放入37℃的搖床，200r/min震蕩培養(yǎng)16～18h，進(jìn)行首次活化；按1∶4的接種比例接種，分別將首次活化后的1mL菌液接種于4mL含Amp（終濃度為200μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，放入37℃搖床，200 r/min震蕩培養(yǎng)2.5h，進(jìn)行二次活化；其后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃，200 r/min誘導(dǎo)4h，收集菌體，分別用100μL PBS懸起，離心20min，包涵體用100μL包涵體溶解液懸起，進(jìn)行SDSPAGE電泳。分別對Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF和pGEX4T-1空載的轉(zhuǎn)化菌液Rosseta(DE3)進(jìn)行未誘導(dǎo)培養(yǎng)，首次活化和二次活化均同上，其后不加入IPTG，但同樣放入37℃搖床，200r/min震蕩培養(yǎng)4h，其余操作均同上。

2.2.3 重組表達(dá)菌株Rosseta(DE3)-pGEX-pEGF的誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

（1）最佳誘導(dǎo)劑濃度試驗：將重組表達(dá)菌株Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每管分別加入終濃度為1mmol/L、0.1mmol/L、0.01mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，15℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16h。收集菌液，提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測，SDS-PAGE檢測對比不明顯時，利用Western Blot技術(shù)進(jìn)行鑒定，對其含量做一個初步判斷。取樣品進(jìn)行Western Blot鑒定，在轉(zhuǎn)膜儀中轉(zhuǎn)膜，取下PVDF膜，用2%雀巢脫脂奶粉-PBS封閉，用PBST洗滌；再用2%雀巢脫脂奶粉-PBS將GST-Tag-Mouse mAb按照1:3000稀釋，進(jìn)行一抗孵育；在同樣的條件下用PBST洗滌；用2%雀巢脫脂奶粉-PBS將Goat anti-Mouse-IgG進(jìn)行1:5000稀釋，進(jìn)行二抗孵育；用PBST洗滌。配制顯色液，棄去PBST溶液，用DBA顯色液顯色，記錄顯色結(jié)果。

（2）最佳誘導(dǎo)溫度和時間試驗：將重組表達(dá)菌株Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF在5℃、10℃、15℃條件下分別誘導(dǎo)培養(yǎng)24h、48h、72h、96h，收集菌液，提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

2.2.4 重組表達(dá)菌株Rossetta(DE3)-pGEXpEGF的誘導(dǎo)表達(dá)以及蛋白純化

（1）對重組表達(dá)菌株Rossetta(DE3)-pGEXpEGF進(jìn)行大量表達(dá)，首次活化將50μL的菌株接種到50mLLB液體培養(yǎng)基中，二次活化將首次活化后的菌液全部轉(zhuǎn)移至200 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基，活化后的菌液按照最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件即加入IPTG至終濃度為0.01 mmol/L，于15℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。收集菌體。

（2）蛋白純化

①按GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書步驟進(jìn)行試驗：在細(xì)菌沉淀中加入裂解緩沖液，充分重懸菌體。加入溶菌酶混勻，冰水浴或冰上放置30min。超聲裂解細(xì)菌，嚴(yán)格控制溫度在4℃以下，離心收集細(xì)菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上，取20μL上清留作檢測。取混合均勻的BeyoGoldTMGST-tag Purification Resin，4℃離心棄去儲存液，向凝膠中加入裂解緩沖液以重懸并平衡凝膠，4℃離心棄液體，重復(fù)平衡2～3次即可，加入細(xì)菌裂解液上清混勻，置于4℃搖床進(jìn)行緩慢震蕩。將裂解液和BeyoGoldTMGST-tag Purification Resin的混合物裝入親和層析柱空柱管中。將純化柱底部的蓋子打開，使柱內(nèi)液體流出，重復(fù)上柱3～5次，收集20μL流穿液留作檢測。洗柱5次，每次加入0.5～1 mL裂解緩沖液，每次收集20μL洗滌液留作檢測。洗脫目的蛋白6次，每次用0.5 mL洗脫緩沖液，收集的洗脫液即為純化的GST標(biāo)簽?zāi)康牡鞍讟悠贰?/p>

②超聲條件優(yōu)化：方案一：超聲功率300W，每次超5s，停5s，合計45min，嚴(yán)格控制溫度4℃以下；方案二：超聲功率300W，每次超5s，間隔10s，合計30min，嚴(yán)格控制溫度4℃以下。

2.2.5 純化蛋白濃度測定

取5μL不同濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)孔中，E1、E2、E3、E4各取5μL樣品到96孔板的樣品孔中，在各孔加入250μL G250染色液，用酶標(biāo)儀測定A595或A560～A610之間的其波長的吸光度，2小時內(nèi)測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計算出樣品中的蛋白濃度。

3 結(jié)果

3.1 重組質(zhì)粒pGEX-pEGF的構(gòu)建

圖1顯示四組克隆均出現(xiàn)了兩條清晰的顯色條帶，大小為250bp的條帶代表的是目的基因pEGF片段，上面的那一條帶代表的是載體pMD18-Tvector的片段，目的載體和目的基因均回收成功。圖2的雙酶切結(jié)果全為陽性，表明重組質(zhì)粒pGEX-pEGF已成功轉(zhuǎn)入克隆菌株TOP10中，重組質(zhì)粒pGEX-pEGF也已成功轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Rossetta(DE3)中。

圖1 p MD18-T Vector-p EGF質(zhì)粒、pGEX載體、pEGF目的片段雙酶切回收鑒定

圖2 pGEX-pEGF重組質(zhì)粒雙酶切及p GEX-pEGF單酶切結(jié)果

3.2 重組表達(dá)菌株Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE電泳檢測

將pGEX-pEGF重組質(zhì)粒、pGEX空載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以及對pGEX-pEGF重組質(zhì)粒、pGEX空載體進(jìn)行未誘導(dǎo)表達(dá)，形成對照，由圖3可知，在26-34kDa處有較明顯條帶，重組質(zhì)粒pGEX-pEGF的誘導(dǎo)表達(dá)大部分在沉淀即包涵體中，未誘導(dǎo)表達(dá)的在26kDa處有條帶，經(jīng)比對可知，此處是GST標(biāo)簽蛋白條帶，上清中表達(dá)量較多?？蛰d體的誘導(dǎo)表達(dá)與未誘導(dǎo)表達(dá)均未有其他明顯條帶。這表明pEGF基因誘導(dǎo)表達(dá)成功。

圖3 pGEX-pEGF重組質(zhì)粒、pGEX空載誘導(dǎo)表達(dá)及未誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳結(jié)果

3.3 重組表達(dá)菌株Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF的誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

對誘導(dǎo)劑IPTG終濃度三個梯度的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE檢測，圖4顯示目的蛋白在包涵體中含量較多，且三個梯度的目的蛋白表達(dá)量并無明顯區(qū)別，而Western Blot鑒定顯示部分蛋白溶解在上清中，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為0.01 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)的上清目的蛋白含量較另外兩組多，其包涵體的目的蛋白含量較另外兩組多，為了目的蛋白能在上清中表達(dá)更多，誘導(dǎo)劑IPTG的最佳終濃度為0.01 mmol/L。圖5顯示，5℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24h、48h、72h和96h相比較，培養(yǎng)24h后的包涵體中目的蛋白較多，培養(yǎng)48h、72h和96h后的上清和包涵體中的目的蛋白含量均無明顯差別，因此5℃誘導(dǎo)表達(dá)最適培養(yǎng)時間是48h。10℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24h與培養(yǎng)48h、72h和96h相比，培養(yǎng)24h包涵體的目的蛋白較多，培養(yǎng)48h、72h和96h后的上清和沉淀中的目的蛋白含量無明顯差別，因此10℃誘導(dǎo)表達(dá)最適培養(yǎng)時間是48h。15℃培養(yǎng)24h與培養(yǎng)48h、72h和96h相比，上清和沉淀中的目的蛋白含量均無明顯差別，由此15℃誘導(dǎo)表達(dá)最適培養(yǎng)時間是24h。經(jīng)比較可得15℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24h的上清包含的目的蛋白較多，且沉淀包含的目的蛋白較少，因此誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度和時間分別是15℃和24h。

圖4 Rossetta(DE3)-p GEX-pEGF蛋白SDS-PAGE電泳和Western Blot結(jié)果

圖5 Rossetta(DE3)-pGEX-p EGF誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果

3.4 重組表達(dá)菌株Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的純化

由圖6可知，超聲45min（圖中序號為①）的純化失敗，超聲35min（圖中序號為②）的純化成功，超聲45min強(qiáng)度較大，導(dǎo)致目的蛋白變性，即目的蛋白幾乎全在流穿液和洗滌液里；反之超聲30min的條件較為溫和，能夠較好洗脫出目的蛋白，即超聲功率300W，每次超5s，間隔10s，合計30min，嚴(yán)格控制溫度4℃以下的超聲效果更好。SDS-PAGE檢測顯示后續(xù)洗脫液的條帶在32kDa附近，表示目的蛋白純化成功。流穿液和洗滌液中目的蛋白含量極少，洗脫液中，E5、E6目的蛋白含量極少，E1目的蛋白含量較少，E3和E4目的蛋白含量較多，E2目的蛋白含量最多。由此可以判斷目的蛋白純化成功并且純化效果尚可。

圖6 p GEX-pEGF蛋白純化結(jié)果

3.5 純化蛋白濃度測定

由標(biāo)準(zhǔn)蛋白測定得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，對純化得到的蛋白進(jìn)行測定得其吸光度，依次為0.610A、0.916A、0.832A、0.707A，將其分別帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式y(tǒng)=0.6735x+0.5505（其中y為測得的樣品吸光度，x為樣品蛋白濃度）計算可得其濃度，依次為0.088mg/mL、0.542mg/mL、0.418mg/mL、0.232mg/mL。具 體結(jié) 果 見 表1。其 中E1、E2、E3、E4分 別 是pGEX-pEGF洗脫第1、第2、第3、第4次所得到的只含有目的蛋白的洗脫液。其中，E2目的蛋白濃度最高，為0.542mg/mL，E1目的蛋白濃度最低，為0.088mg/mL。該結(jié)果均與圖6中②號純化結(jié)果圖顯示的目的蛋白含量基本一致。

表1 純化產(chǎn)物的濃度測定

4 討論

豬表皮生長因子（pEGF）具有激發(fā)細(xì)胞分裂、增殖與分化，促進(jìn)離子交換、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、糖代謝和細(xì)胞外基質(zhì)的合成的功能。此外，pEGF還通過促進(jìn)斷奶仔豬的生長，提高仔豬免疫力[17]，其在養(yǎng)豬業(yè)的應(yīng)用前景十分廣闊。

為pEGF能在養(yǎng)豬業(yè)得到良好而穩(wěn)定的應(yīng)用，本研究對pEGF基因進(jìn)行了構(gòu)建、表達(dá)以及純化。不同于枯草芽孢桿菌[18]和畢赤酵母[19]，遺傳背景清楚、易操作、生長繁殖速度快、可大量培養(yǎng)的大腸桿菌[20]更適合作為本研究的表達(dá)系統(tǒng)。本研究直接對人工合成的重組質(zhì)粒PMD18-T Vector-pEGF進(jìn)行雙酶切，將核酸電泳回收的pEGF與質(zhì)粒載體pGEX4T-1進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pGEX-pEGF，與史飛等大部分的研究不同的是pEGF基因沒有進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而是直接與原核表達(dá)載體進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒，避免了因PCR擴(kuò)增引起的基因突變[21]。本研究采取GST-pEGF融合表達(dá)，由邱淑彬的研究可知，有His-Tag的表達(dá)系統(tǒng)，目的產(chǎn)物的表達(dá)量高不易純化，有GST-Tag的表達(dá)系統(tǒng)，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高易純化，且GST-Tag能增加外源蛋白的可溶性，但是GST-Tag比較大，對后續(xù)的影響也會較大，可根據(jù)后續(xù)研究目的進(jìn)行酶切試驗[22]。誘導(dǎo)表達(dá)重組菌株Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF并進(jìn)行SDS-PAGE檢測可知基因pEGF誘導(dǎo)表達(dá)成功，但發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中目的蛋白主要以包涵體的形式存在，可溶性表達(dá)產(chǎn)物含量極低，胞內(nèi)可溶性蛋白的表達(dá)量與誘導(dǎo)條件有關(guān)[23]。為了提高目的蛋白的可溶性表達(dá)，減少在包涵體中的表達(dá)，對其進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化，分別進(jìn)行了誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間的誘導(dǎo)條件優(yōu)化。且純化試劑盒只能用于純化可溶性蛋白，因此，要做到誘導(dǎo)表達(dá)后上清中目的蛋白含量盡量多。最終探索出最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為IPTG終濃度0.01 mmol/L、誘導(dǎo)溫度15℃和誘導(dǎo)時間24h。表達(dá)產(chǎn)物中雜蛋白極多，需對其進(jìn)行純化，但GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對蛋白的活性要求極高，對于菌體冰上超聲的溫度和破碎的時間需嚴(yán)格控制，超聲時菌體溫度過高或超聲時間過長都會導(dǎo)致蛋白變性而無法與凝膠結(jié)合。超聲方案一的超聲時間過長且條件劇烈，易導(dǎo)致蛋白變性，相比之下方案二的超聲條件溫和，能較好地純化出目的蛋白，蛋白純化后進(jìn)行的SDS-PAGE電泳檢測和蛋白濃度的定量檢測均顯示出E2目的蛋白含量最高，E3次之。史飛等對收集的菌體進(jìn)行進(jìn)行超聲破碎的參數(shù)設(shè)置為：功率1200W、超5秒停9秒、共90次[21]，超聲條件無溫度要求，無法判斷是否對純化后蛋白的活性有要求，相較而言本研究的超聲條件更為溫和，更能保證后續(xù)純化目的蛋白的活性。王強(qiáng)等的研究沒有進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化獲得更多的目的蛋白，目的蛋白以包涵體形式存在，用Ni親和層析柱進(jìn)行純化，此種方式純化的目的蛋白需要復(fù)性[24],操作較為繁雜。而本研究進(jìn)行了表達(dá)條件優(yōu)化，提高可溶性目的蛋白的表達(dá)量，采用GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化，純化所得的目的蛋白具活性，不需要進(jìn)行復(fù)性，操作上更為簡便。但是這兩種純化方法的成本都偏高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)，應(yīng)當(dāng)再摸索成本低效果好的純化方法，為pEGF在養(yǎng)豬業(yè)的應(yīng)用上提供技術(shù)支持。

圖7 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

本研究對表達(dá)條件及超聲條件進(jìn)行了優(yōu)化，最大程度地提高了pEGF的表達(dá)量，摸索出了良好的純化工藝，純化所得蛋白最高純度為0.542mg/mL，但純化量較小且成本高，后續(xù)應(yīng)摸索低成本純化量大的批量純化方法，推進(jìn)pEGF蛋白的工業(yè)生產(chǎn)以及在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。

5 結(jié)論

本研究人工合成、克隆及表達(dá)了pEGF基因，通過GST-tag親和層析純化方法提高了pEGF的純度，為pEGF的后續(xù)研究、開發(fā)以及應(yīng)用提供了依據(jù)。 □