非洲豬瘟檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

方 勤，叢 彬，唐 偉

（永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 永州 425000）

非洲豬瘟（ASF）1914年起源于坦桑尼亞，1921年在肯尼亞首次報(bào)道，1957年首次傳出非洲大陸進(jìn)入歐洲西部，2007年傳入東歐和俄羅斯西部，2017年傳入俄羅斯東部，2018年傳入我國(guó)。非洲豬瘟病毒（ASFV）可在鈍緣軟蜱中長(zhǎng)期存在，使得其很難被凈化，主要是由于其容易形成“家豬—鈍緣軟蜱—家豬和家豬—鈍緣軟蜱—野豬”循環(huán)傳播，目前已知的能傳播ASFV的鈍緣軟蜱有7大類，分別是歐洲的游走鈍緣軟蜱、非洲的非洲鈍緣軟蜱復(fù)合種、糙皮鈍緣軟蜱、帕氏鈍緣軟蜱、圓卡鈍緣軟蜱、波多鈍緣軟蜱和摩洛鈍緣軟蜱[1]。

ASFV是一種結(jié)構(gòu)對(duì)稱的二十面體雙鏈DNA病毒，直徑在175～215nm，擁有24個(gè)基因型，基因組長(zhǎng)度為170～194kb，含有150～167個(gè)開放閱讀框，能編碼150～200種的蛋白質(zhì)[2]。病毒粒子包含5層結(jié)構(gòu)，由內(nèi)到外依次是擬核、內(nèi)核衣殼、內(nèi)膜、衣殼、外膜。擬核的主要結(jié)合蛋白包括p10（pK78R）和p14.5（pE120R），內(nèi)核衣殼蛋白主要包括pp220（pC475L）和pp62（pCP530R），pp220可裂解為p150、p37、p14和p34四種蛋白，pp62可裂解為p35和p15兩種蛋白，內(nèi)膜蛋白主要包括p17（pD117L）、p54（pE183L）、p12（pO61R）、p30（pCP204L）、p22（pKP177R）、pE248R、j5R（pH108R）、j13L（pE183L）和j18L（pE199L），衣殼蛋白主要包括p72（pB646L）、p49（pB438L）、p14.5（pE120R）、pH240R和pM1249L，外膜蛋白主要包括CD2v（Ep402R）和p12（pO61R）。其中p72、p30、p54和CD2v是ASFV重要的毒力蛋白[3]。

1 病原學(xué)檢測(cè)

1.1 紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（HAD）

HAD依賴于體外培養(yǎng)的感染ASFV的巨噬細(xì)胞能夠使紅細(xì)胞吸附在其細(xì)胞膜上，形成紅細(xì)胞玫瑰花環(huán)，但是有的ASFV能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生病變使其不能形成紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。如果出現(xiàn)不吸附現(xiàn)象，可利用免疫熒光檢測(cè)方法將特異性熒光抗體與ASFV結(jié)合，通過顯微鏡觀察顯色結(jié)果可檢出ASFV，能夠提高檢出率。但是巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，HAD的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3d～10d且與病毒含量有關(guān)，所以這種方法除了不能100%檢出ASFV，而且對(duì)慢性病例檢出率會(huì)降低，因而通常作為一種補(bǔ)充檢測(cè)方法[4]。

1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR是利用ASFV結(jié)構(gòu)蛋白設(shè)計(jì)特異性的引物，然后加入酶和四種脫氧核糖核苷酸，經(jīng)過變性、退火和延伸3個(gè)基本反應(yīng)步驟進(jìn)行擴(kuò)增?；诓煌幕蛟O(shè)計(jì)不同的引物，如吳憶春等[5]根據(jù)ASFV的vp73基因序列設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)靈敏度為10-7ng/μg，李云燦等[6]根據(jù)ASFV的vp72基因序列設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)靈敏度為10-8ng/μg，兩種引物的設(shè)計(jì)檢測(cè)靈敏度均達(dá)到和優(yōu)于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）的推薦方法。

1.3 熒光定量PCR（qPCR）

qPCR可根據(jù)ASFV的基因vp72、vp73、P54、K205設(shè)計(jì)引物和探針，是一種將PCR與光譜結(jié)合的核酸定量檢測(cè)技術(shù)。qPCR有熒光染料法和探針法，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針跟蹤PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并將其產(chǎn)生的信號(hào)實(shí)時(shí)收集，最后用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量的分析。熒光染料法以SYBR Green I為代表，主要由于其通用性好、成本低，SYBRGreen I發(fā)出的熒光較弱，但是結(jié)合到DNA的雙螺旋小溝區(qū)域后熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)[7]。探針法主要是利用PCR反應(yīng)中標(biāo)記熒光染料的特異性寡核苷酸探針來檢測(cè)產(chǎn)物，目前使用最多的是vp72的B646L作為靶點(diǎn)的TaqMan探針和9GL為靶點(diǎn)的MGB探針[8]。qPCR的檢測(cè)靈敏度非常高，如曾少靈等[9]基于vp73建立的qPCR最低檢測(cè)限可達(dá)10copies/μL，董志珍等[10]基于ASFV的P54建立的qPCR最低檢測(cè)限可達(dá)15 copies/μL，黃萍等[11]基于ASFV的vp72建立的qPCR最低檢測(cè)限可達(dá)100copies/μL。

1.4 微滴數(shù)字PCR（ddPCR）

ddPCR是在數(shù)字PCR（dPCR）的基礎(chǔ)上將液滴微流控芯片與dPCR技術(shù)相結(jié)合，具有dPCR高靈敏度、高通量和低消耗的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了dPCR芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成本高和加工困難的缺點(diǎn)。ddPCR不需要使用標(biāo)準(zhǔn)樣品，相較qPCR不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，能直接讀出DNA分子的個(gè)數(shù)做到絕對(duì)定量。ddPCR通過反應(yīng)體系配制、樣品微滴化處理、PCR擴(kuò)增和微滴檢測(cè)讀取四個(gè)步驟后，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個(gè)數(shù)和比例得出靶分子的拷貝數(shù)或濃度。ddPCR的檢測(cè)靈敏度比qPCR更為靈敏，如鄔旭龍等[12]基于ASFV的K205R基因設(shè)計(jì)的特異性引物建立的ddPCR的最低檢測(cè)限為10copies/μL，原霖等[13]基于ASFV的vp72基因設(shè)計(jì)的特異性引物建立的ddPCR的最低檢測(cè)限為0.8copies/μL。由于ddPCR檢測(cè)靈敏且不依賴標(biāo)準(zhǔn)樣品，可用于飼料、飲水和豬肉產(chǎn)品中微量核酸的檢測(cè)，對(duì)早期檢測(cè)意義重大，但是其檢測(cè)所需要的儀器價(jià)格昂貴，普及還需要一定時(shí)間。

1.5 等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種在恒溫條件下的DNA擴(kuò)增技術(shù)，用于檢測(cè)ASFV主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）、重組聚合酶輔助擴(kuò)增技術(shù)（RAA）、交叉引物擴(kuò)增技術(shù)（CPA）等多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[14]。

LAMP是一種DNA擴(kuò)增的單管技術(shù)，對(duì)目標(biāo)DNA鏈上的不同區(qū)段設(shè)計(jì)不同的引物和具有復(fù)制活性、高鏈置換活性的聚合酶，在60℃～65℃的恒溫環(huán)境下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法[15]。LAMP相較PCR而言，不需要專業(yè)的熱循環(huán)儀，只要恒溫設(shè)備即可擴(kuò)增，更適宜在現(xiàn)場(chǎng)和非實(shí)驗(yàn)的條件下進(jìn)行檢測(cè)，并且已有檢測(cè)試劑盒，如北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司開發(fā)的非洲豬瘟病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，所以LAMP具有使用簡(jiǎn)單、檢測(cè)方便等特點(diǎn)[16]。它的靈敏度也非常高，Wu等基于ASFV的K205R基因序列設(shè)計(jì)的LAMP引物的最低檢測(cè)限為6copies/μL。

RPA是一種由DNA重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換聚合酶參與的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，DNA在體外擴(kuò)增溫度為25℃～45℃，基本不需要加熱即可完成雙鏈DNA的解鏈處理并進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，而且擴(kuò)增時(shí)間較短一般不超過20min，相較qPCR而言檢測(cè)效率明顯更高，而且檢測(cè)限度也不弱于qPCR，如Zhai等[7]以ASFV的vp72基因與K205R基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)的RPA-LFD法，最低檢測(cè)限為100copies/μL。

RAA是具有我國(guó)專利的一種等溫檢測(cè)技術(shù)，是RPA技術(shù)的一種改良。RAA體系中的重組酶來源于細(xì)菌或真菌較來源于噬菌體的RPA更易得到，而且溫度適應(yīng)性更強(qiáng)。39℃在重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和聚合酶的作用下10～20min就可完成核酸的擴(kuò)增，且較RPA靈敏度更高，如Fan等[7]基于ASFV的B646L基因建立的RPA方法和RAA方法最低檢測(cè)限為93.4copies/μL和53.6copies/μL，趙凱穎等[17]基于ASFV的B646L基因建立RAA方法最低檢測(cè)限為10copies/μL。

CPA是我國(guó)首個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，是一類利用多個(gè)引物和探針的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，它的引物有1個(gè)或多個(gè)是交叉引物，依賴DNA聚合酶的高活性鏈置換特性擴(kuò)增DNA。CPA不需提取DNA，且無交叉反應(yīng)，比LAMP靈敏度高但檢出率不如LAMP，Wozniakowski等[7]對(duì)比了LAMP與CPA兩種等溫檢測(cè)方法去檢測(cè)ASFV，靈敏度方面LAMP的最低檢測(cè)限為300copies/μL，CPA的最低檢測(cè)限為7.2copies/μL，但LAMP的陽性檢出率為90%，CPA只有70%。

2 血清學(xué)檢測(cè)

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA是血清學(xué)檢測(cè)最常用的方法，其基本原理是吸附在固相載體上抗原或抗體在酶標(biāo)物的作用下發(fā)生特異性的反應(yīng)，利用底物顯色做一些定性或定量的分析?；贓LISA，發(fā)展出了阻斷ELISA、間接ELISA和雙夾心ELISA等方法[18]。阻斷ELISA的原理是通過包被的ASFV蛋白與ASFV特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，再進(jìn)行氧化物酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，通過底物顯色深淺進(jìn)行抗體的陽性檢測(cè)。間接ELISA是通過包被蛋白與樣品中抗體反應(yīng)，再與酶標(biāo)抗體結(jié)合，加入底物顯色來確定其ASFV抗體是否為陽性。雙抗夾心ELISA是特異性抗體與固相載體結(jié)合，加入待檢測(cè)抗原后再加入酶標(biāo)抗體，最后用底物進(jìn)行顯色，根據(jù)顯色的深淺做一些定性或定量分析。ELISA檢測(cè)靈敏度高，具有特異性，操作簡(jiǎn)單，能夠用于大量樣本的檢測(cè)。目前，ASFV在ELISA的檢測(cè)中使用最多的抗原蛋白有p30、p54、p72和p73等，如Cubillos等[7]利用ASFV的p30建立的ELISA，梁云浩等[19]利用ASFV的p54建立的間接ELISA，曹琛福等[20]利用ASFV的p54建立的阻斷ELISA，Vidal MI等[21]利用ASFV的p72建立的雙夾心ELISA。

2.2 膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）

GICA是一種以膠體金作為顯色媒介標(biāo)記抗原或抗體作為示蹤標(biāo)記物，以纖維素膜作為載體在層析過程中完成反應(yīng)從而達(dá)到檢測(cè)目的的免疫標(biāo)記技術(shù)。GICA適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)ASFV，其檢測(cè)簡(jiǎn)單快速且對(duì)設(shè)備要求不高。GICA的建立需要設(shè)計(jì)專門的檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線會(huì)根據(jù)靶目標(biāo)的存在與否出現(xiàn)顯色或不顯色，質(zhì)控線能夠確認(rèn)試紙的檢測(cè)是否正常。GICA通常利用葡萄球菌A蛋白（SPA）作為檢測(cè)線，纖維素膜包被的ASFV的p54或p72多克隆抗體作為質(zhì)控線，如張?chǎng)斡畹萚22]建立的p54抗體膠體金檢測(cè)法，以SPA作為檢測(cè)線，抗p54多克隆抗體作為質(zhì)控線，戴建華等[23]根據(jù)膠體金免疫層析原理制作的膠體金免疫層析試紙，以ASFV的p54抗原作為金標(biāo)墊，SPA為檢測(cè)線，p54多克隆抗體為質(zhì)控線，吳海濤等[24]制備的檢測(cè)ASFV的p72膠體金免疫試紙條，以SPA作為檢測(cè)線，抗p72多克隆抗體作為質(zhì)控線。

2.3 免疫印跡法（IBT）

IBT是一種利用凝膠電泳分離不同組分的蛋白質(zhì)固定于印跡紙上，以特異性抗體為探針，建立免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶抗原蛋白質(zhì)的檢測(cè)。AFSV的IBT通常以重組蛋白P30和p54等建立免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)，如Barderas等[7]利用粉紋夜蛾幼蟲制備的ASFV重組蛋白p30建立免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)，Kazakova A S等[7]將ASFV的重組蛋白p30克隆成原核表達(dá)載體，經(jīng)表達(dá)純化后建立了高純度重組蛋白p30的免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)，Alcaraz等[25]在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白p54，建立了ASFV重組蛋白p54的免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)。

3 小結(jié)

ASF檢測(cè)方法的選擇通常要根據(jù)具體情況而定，每種檢測(cè)方法都有它的優(yōu)缺點(diǎn)。如qPCR的優(yōu)點(diǎn)是快速，靈敏度高，不容易交叉污染，缺點(diǎn)是成本高，需配套儀器，容易出現(xiàn)假陽性。RPA的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)儀器要求低，快速特異，操作簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是易出現(xiàn)假陽性。ELISA的優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用廣泛，可用于大量樣本檢測(cè)，缺點(diǎn)是被檢動(dòng)物需要產(chǎn)生抗體。GICA的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)快速，穩(wěn)定性高，可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，缺點(diǎn)是易出現(xiàn)假陽性，不能定量。IBT快速靈敏，可以避免在抗原生產(chǎn)中使用活毒，缺點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)非特異性反應(yīng)[26,27]?？傊瑱z測(cè)方法的使用要相互輔助，同時(shí)大力加強(qiáng)對(duì)新方法的開發(fā)，使ASFV的無所遁形。 □