TCF23基因與寧鄉(xiāng)豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)研究

唐 婧，何 俊，葉 旭，湯 香，蔣 雋※

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教育學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖南 長沙 410128）

1 前言

母豬的繁殖性狀是重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一。母豬繁殖能力的提高可直接影響生豬業(yè)的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。豬育種研究者們和養(yǎng)豬行業(yè)一直在密切關(guān)注并研究如何改善母豬的繁殖性狀[1-5]。然而，繁殖性狀屬于遺傳力較低的性狀，因此通過傳統(tǒng)育種方法有效改善母豬的生殖性狀非常緩慢。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的興起和不斷發(fā)展，動(dòng)物遺傳改良迎來了新的機(jī)遇。豬繁殖性狀的遺傳改良已成為新的研究浪潮。與母豬繁殖性狀密切相關(guān)的基因的結(jié)構(gòu)和功能將得到深入研究，以尋找相應(yīng)的遺傳標(biāo)記[6-9]。

寧鄉(xiāng)豬是我國著名的地方品種之一，已有上千年的繁衍歷史，因其肉質(zhì)優(yōu)良、性情溫順以及適應(yīng)性強(qiáng)等特性，被稱為國家重要家畜基因庫，然而與長白豬、大白豬等國外品種相比其繁殖力較低，這顯著限制寧鄉(xiāng)豬的擴(kuò)繁增產(chǎn)。因此，本研究基于前期采用GWAS技術(shù)在寧鄉(xiāng)豬中初步篩選到的候選基因TCF23，采用PCR-RFCP技術(shù)進(jìn)一步研究該基因與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)，為運(yùn)用分子生物技術(shù)提寧鄉(xiāng)豬繁殖性能奠定一定的基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)從湖南省寧鄉(xiāng)市某種豬場選擇170頭經(jīng)產(chǎn)的寧鄉(xiāng)母豬作為研究對象對試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行活體采樣。寧鄉(xiāng)豬均來源一致，且飼養(yǎng)環(huán)境和飼料環(huán)境相同，用耳號鉗采取指甲大小的耳組織，放入裝有75%乙醇的1.5mL離心管中，并在離心管上做好耳樣標(biāo)記，放入-20℃保存。

試驗(yàn)研究的繁殖性狀來源于種豬場的母豬記錄，包括豬總產(chǎn)仔數(shù)（TNB）、產(chǎn)活仔數(shù)（NBA）、初生仔豬死亡數(shù)和仔豬成活率等頭三胎的繁殖性狀。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 耳組織樣DNA提取與檢測

采用傳統(tǒng)苯酚氯仿抽提法提取寧鄉(xiāng)豬的DNA，將提取的DNA保存于-20℃?zhèn)溆肹10]。

2.2.2 目的DNA片段的PCR擴(kuò)增

參照NCBI公布的豬TCF23基因（登錄號：NC_010445.4）DNA外顯子序列進(jìn)行設(shè)計(jì)引物序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件及NCBI中的Primer-BLAST等設(shè)計(jì)PCR的引物（由長沙擎科生物科技有限公司合成）。引物序列見表1。

對寧鄉(xiāng)豬DNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增所用的引物序列及詳細(xì)擴(kuò)增片段信息見表1。使用長沙博儀生物科技有限公司2×Rapid Taq Master Mix進(jìn)行PCR試驗(yàn)，PCR總體系為50mL。反應(yīng)結(jié)束后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR的反應(yīng)體系及程序見表2、表3。

表1 PCR引物序列列表

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)程序

2.2.3 PCR產(chǎn)物檢測

使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，操作步驟如下：

（1）使用天平稱取近1.0g瓊脂糖粉置于200mL三角瓶中，再100mL 1×TAE，搖晃混勻，放入微波爐中加熱90s至沸騰，取出晃使瓊脂糖粉充分溶解。

（2）室溫下冷卻至55℃～70℃左右，加入核酸染料,搖晃使其混合均勻。

（3）將瓊脂糖膠溶液倒入已插好梳子的樣板中，注意勿出現(xiàn)氣泡。室溫下放置30min左右，代膠液完全凝固，取出梳子。

（4）取5μL待檢測DNA樣品與1μL 6×DNA Loading Buffer混合均勻，點(diǎn)入樣孔。

（5）將瓊脂糖凝膠置于電泳槽中，并使電泳槽中的TAE覆蓋點(diǎn)樣孔至1mm，開啟電泳儀，電壓調(diào)節(jié)為110V,電泳30min。

（6）電泳結(jié)束后，取出凝膠，放入凝膠成像儀下觀察并拍照保存。

（7）若電泳條帶整齊、明亮、無拖尾，分子量大小與目的片段相吻合，送去湖南擎科生物有限公司測序。

2.2.4 PCR-RFLP多態(tài)性檢測

選用限制性內(nèi)切酶做單酶反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系為31mL，其中取10mLPCR反應(yīng)產(chǎn)物，限制性內(nèi)切酶1mL（10U），10×buffer Tango 2mL，加水至31mL。37℃反應(yīng)8小時(shí)。酶切產(chǎn)物以600bp DNAMarker對照，使用2%的瓊脂糖凝膠，并在120V電壓下電泳35min進(jìn)行檢測，紫外燈下觀察，并拍照判斷基因型。

2.2.5 候選基因部分序列測序

通過對不同外顯子進(jìn)行各種酶切尋找多態(tài)位性，發(fā)現(xiàn)TCF23-2段上出現(xiàn)多態(tài)性。選取不同條帶的各三個(gè)，找到相對應(yīng)的豬DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后送往湖南擎科生物有限公司測序，測序公司返回結(jié)果峰圖，測序結(jié)果利用Lasergene軟件中的SeqMan程序及DNAMAN生物軟件查看，將測序結(jié)果與Genen Bank上豬的相應(yīng)DNA序列對比，以尋找出擴(kuò)增片段的堿基突變位點(diǎn)。

2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS20軟件進(jìn)行各基因突變位點(diǎn)多態(tài)性與性狀間的關(guān)聯(lián)分析，用單因素ANOVA方差分析顯著性?；蜷g聯(lián)合分析，用一般線性模型中單變量分析，聯(lián)合分析中將各突變位點(diǎn)中個(gè)體數(shù)多的純合基因型統(tǒng)一用純合型AA表示，個(gè)體數(shù)少的純合基因型用純合型BB表示，雜合基因型用雜合型AB表示。分析選用Duncan多重比較檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因組DNA提取效果

共提取了170頭寧鄉(xiāng)豬耳組織DNA，經(jīng)分光光度計(jì)檢測得出DNA的OD260/280值在1.8～2.0正常范圍內(nèi)無蛋白質(zhì)污染。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1。由圖1可見，電泳條帶整齊、明亮、無拖帶現(xiàn)象。證明提取的DNA質(zhì)量符合要求，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 基因組DNA電泳檢測結(jié)果

3.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖可見，電泳條帶清晰明亮，且與目的片段吻合，可知PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物特異性較高，可以進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

圖2 TCF23-2電泳檢測結(jié)果

3.3 PCR-RFLP檢測結(jié)果

寧鄉(xiāng)豬基因TCF23第2外顯子片段擴(kuò)增產(chǎn)物存在兩個(gè)SmaⅠ酶切位點(diǎn)，將產(chǎn)物切為380 bp、125bp和44bp三個(gè)片段，但與酶切出來的條帶不符，通過測序?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)寧鄉(xiāng)豬基因TCF23第2外顯子序列片段在122bp處突變形成酶切位點(diǎn)以及突變形成的位點(diǎn)上存在堿基突變導(dǎo)致每種基因型帶有不同片段，其中AA型顯示條帶有（169bp、380bp）、（122bp、169bp、258bp）和（122bp、169bp、258bp、380bp）、GG型 顯 示 條 帶 有（44bp、125bp、380bp）、（44bp、122bp、125bp、258bp） 和（44bp、122bp、125bp、258bp、380bp）雜合子AG基因型顯示 條 帶 有（44bp、125bp、169bp、380bp）、（44bp、122bp、125bp、169bp、258bp）以 及（44bp，122bp、125bp、169bp、258bp、380bp），其中小于100bp在膠圖中不能顯示。如圖3。

圖3 引物TCF23-2 PCR產(chǎn)物RFLP檢測圖

3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物測序的結(jié)果

將TCF23基因（GenBank登錄號為NC_010445.4）第2外顯子（TCF23-2擴(kuò)增片段）進(jìn)行酶切所產(chǎn)生的不同條帶，選取不同條帶的各三個(gè)，找到相對應(yīng)的豬DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后送往公司測序。將TCF23-2 PCR-SmaⅠ-RFLP酶切結(jié)果與測序列結(jié)果對比驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TCF23第2外顯子387堿基處存在G→A類型突變（G387A）突變位點(diǎn)，測序比對結(jié)果見圖4。將TCF23基因第2外顯子387位點(diǎn)沒有發(fā)生突變的純合子個(gè)體為GG型，由G突變成A的純合子個(gè)體命名為AA型，由G突變成A的雜合子個(gè)體命名為AG型，測序峰圖見圖5。測序分析結(jié)果與酶切結(jié)果符合。

圖4 TCF23-2片段序列對比結(jié)果

3.5 SNPs及其與寧鄉(xiāng)豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

基因多態(tài)性與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表4。寧鄉(xiāng)豬TCF23基因G387A位點(diǎn)上，突變AA基因型總產(chǎn)仔數(shù)為最高，其次為AG雜合型，野生GG基因型總產(chǎn)仔數(shù)為最低。其中AA基因型總產(chǎn)仔數(shù)高于AG基因型和GG基因型且總產(chǎn)仔數(shù)差異上達(dá)到了顯著水平（P＜0.05），不同基因型寧鄉(xiāng)豬的成活率、產(chǎn)活仔數(shù)和初生豬仔死亡均無顯著差異性（P＞0.05）。

表4 三個(gè)基因多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

4 討論

TCF23(轉(zhuǎn)錄因子23)是一種蛋白編碼基因，屬于基因編碼基本螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)成員。參與多種細(xì)胞分化過程，有研究表明TCF23主要在成年小鼠的生殖器官如卵巢、子宮和睪丸等組織中表達(dá)，在發(fā)育中的胚胎組織中幾乎檢測不到TCF23[11]。KommaganiR等[12]，對卵巢切除的小鼠的子宮內(nèi)膜組織RNA進(jìn)行了全基因組比較轉(zhuǎn)錄譜分析，揭示轉(zhuǎn)錄因子23是人類子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化所必需。

目前還沒有關(guān)于TCF23基因與豬繁殖狀關(guān)聯(lián)的相關(guān)性的報(bào)道，本研究結(jié)果表明，TCF23基因G387A位點(diǎn)對寧鄉(xiāng)豬的總產(chǎn)仔數(shù)具有顯著影響，可作為高產(chǎn)仔數(shù)母豬個(gè)體的遺傳標(biāo)記。但該位點(diǎn)所在的基因是否可以作為寧鄉(xiāng)豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的候選基因，還須進(jìn)一步對其功能進(jìn)行驗(yàn)證。 □