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    市售魚(yú)加工食品中3 種晚期糖基化終末產(chǎn)物分析及與組分的相關(guān)性

    2022-06-02 08:42:32周鵬程曾名湧董士遠(yuǎn)
    食品科學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:罐頭總糖脂肪

    安 婧,張 琪,于 楠,周鵬程,曾名湧,董士遠(yuǎn)

    (中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266003)

    晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)是糖類(lèi)與蛋白質(zhì)、氨基酸等經(jīng)美拉德反應(yīng)形成的一類(lèi)復(fù)雜化合物總稱(chēng)。AGEs種類(lèi)眾多,廣泛存在于生物體與食品中。研究發(fā)現(xiàn),膳食中AGEs是體內(nèi)AGEs積累的重要來(lái)源,其AGEs在體內(nèi)積累與糖尿病、阿爾茲海默癥、帕金森綜合征等慢性疾病密切相關(guān)。目前,已對(duì)食品中代表性AGEs——羧甲基賴(lài)氨酸(N-carboxymethyllysine,CML)開(kāi)展廣泛研究,而對(duì)羧乙基賴(lài)氨酸(N-carboxyethyllysine,CEL)、甲基乙二醛氫咪唑酮(N-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine,MG-H1)等其他AGEs的研究已成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)。

    食品中AGEs形成與其組成成分、加工工藝等密切相關(guān)。Assar等發(fā)現(xiàn)牛肉中CML含量隨熱處理程度的增加而增加;Tavares等發(fā)現(xiàn)干熱加工對(duì)AGEs形成的促進(jìn)作用高于濕熱加工。Goldberg等發(fā)現(xiàn)脂肪和蛋白含量高的食物中AGEs含量較高,而由碳水化合物組成的食物(淀粉、蔬菜、水果)AGEs含量較低。魚(yú)加工食品在烘烤、煎炸等高溫加工中易促進(jìn)AGEs的形成。然而,目前國(guó)內(nèi)尚缺乏針對(duì)市售魚(yú)加工食品中AGEs含量方面的研究。分析市售魚(yú)加工食品中AGEs水平,有利于提升其安全水平。因此,本研究嘗試建立魚(yú)加工食品中3 種AGEs含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLCMS/MS)檢測(cè)方法,使用該方法分析65 種市售魚(yú)加工食品的AGEs含量及組成成分,揭示其AGEs含量與組成成分的關(guān)系,為探究魚(yú)加工食品AGEs含量檢測(cè)與限量標(biāo)準(zhǔn)建立提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    實(shí)驗(yàn)用魚(yú)加工食品均購(gòu)于青島臺(tái)東沃爾瑪購(gòu)物中心。

    CML、CEL、CML-、CEL-標(biāo)準(zhǔn)品 加拿大Toronto Research Chemicals公司;MG-H1標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)International Laboratory公司;MG-H1-標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Bioberry公司;其他試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ACQUITY UPLC儀、Xevo TQ-S MS儀、ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、Atlantis HILIC Silica(2.1 mm×100 mm,3 μm)、Symmetry C(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)美國(guó)Waters公司;KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器昆山超聲儀器有限公司;SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司;BCD-190TMPK冰箱青島海爾股份有限公司;DHG-9036A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;LC-CQ-24F固相萃取裝置 上海力辰邦西儀器科技有限公司;N-20多功能氮吹儀 山東云網(wǎng)科技有限公司;8400全自動(dòng)凱氏定氮儀瑞典福斯公司;SXT-06索氏提取器 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;Synergy H4酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品分組

    選取市場(chǎng)上代表性烘烤類(lèi)、油炸類(lèi)、罐頭類(lèi)和干制類(lèi)等65 種魚(yú)加工食品,置于-20 ℃保存。

    1.3.2 AGEs含量測(cè)定

    1.3.2.1 樣品前處理

    將約300 g魚(yú)加工食品粉碎并混合均勻,稱(chēng)取20 mg待分析樣品加入0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液和2 mol/L硼氫化鈉溶液,4 ℃條件下還原8 h;加入6 mol/L HCl溶液后110 ℃水解24 h;烘干復(fù)溶后加入CML-、CEL-、MG-H1-標(biāo)準(zhǔn)品溶液,過(guò)濾膜后進(jìn)行固相萃?。ㄓ眉状己腕w積分?jǐn)?shù)2%甲酸溶液依次活化MCX柱,待測(cè)液過(guò)柱后用2%甲酸溶液和甲醇依次除雜,用5%氨水-甲醇洗脫目標(biāo)化合物);氮吹至近干,復(fù)溶,過(guò)濾膜,待測(cè)。

    1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    分別稱(chēng)取CML、CEL、MG-H1、CML-、CEL-、MG-H1-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各5 mg(精確至0.001 mg),用超純水配制5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于-20 ℃冰箱保存。配制3 種AGEs內(nèi)標(biāo)溶液,質(zhì)量濃度均為50 ng/mL,繪制0~200 ng/mL范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.2.3 色譜條件

    色譜柱:ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);柱溫35 ℃;進(jìn)樣量3.0 μL;流速0.3 mL/min;流動(dòng)相:0.25 mol/L乙酸銨和體積分?jǐn)?shù)1%甲酸溶液為A相,乙腈為B相;梯度洗脫程序:0~1.0 min,15% A、85% B;1.0~6.5 min,15%~35% A、85%~65% B;6.5~9.0 min,35% A、65% B;9.0~10.0 min,35%~15% A、65%~85% B。

    1.3.2.4 MS條件

    離子源:電噴霧離子源正離子模式;毛細(xì)管電壓3.0 kV;錐孔電壓30 V;脫溶劑氣溫度450 ℃;離子源溫度150 ℃;脫溶劑氣流速850 L/h;錐孔反吹氣流速150 L/h;碰撞氣流速0.12 mL/min;采集模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);CML、CEL、MG-H1的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

    表1 AGEs多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)采集參數(shù)Table 1 Multiple reaction monitoring mass spectrometric parameters for analysis of AGEs

    1.3.3 蛋白、脂肪、總糖、水分含量測(cè)定

    蛋白質(zhì)測(cè)定:按照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法;脂肪測(cè)定:按照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》中索氏提取法;總糖測(cè)定:按照GB/T 9695.31—2008《肉制品 總糖含量測(cè)定》中苯酚硫酸法;水分含量測(cè)定:按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法。

    1.3.4 乙二醛(glyoxal,GO)、甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO)含量測(cè)定

    1.3.4.1 樣品前處理

    取0.2 g樣品加入5 mL體積分?jǐn)?shù)30%甲醇溶液(磷酸鹽緩沖液配制),振蕩1 h后離心15 min,取上清液加入10 mg/mL鄰苯二胺溶液,60 ℃暗條件下衍生1 h,用甲醇和超純水依次活化Poly-Sery HLB-Pro固相萃取柱,待測(cè)液過(guò)柱后用超純水除雜,用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液洗脫,過(guò)0.22 μm聚醚砜濾膜待測(cè)。

    1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    配制0、0.05、0.10、0.15、0.20 μg/mL GO、MGO標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入10 mg/mL鄰苯二胺溶液,60 ℃暗條件下衍生1 h,用甲醇和超純水依次活化Poly-Sery HLB-Pro固相萃取柱,待測(cè)液過(guò)柱后用超純水除雜,用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液洗脫,過(guò)0.22 μm PES濾膜待測(cè)。

    1.3.4.3 色譜條件

    色譜柱:Symmetry C色譜柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm);柱溫25 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流速0.3 mL/min;流動(dòng)相:體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸溶液(A 相)和甲醇(B相),梯度洗脫程序:0~2.5 min,70%~40% A、30%~6 0% B;2.5~5.0 min,4 0%~3 0% A、60%~7 0% B;5.0~7.0 min,30%~70% A、70%~30% B;7.0~10.0 min,70% A、30% B。

    1.3.4.4 MS條件

    質(zhì)譜條件見(jiàn)1.3.2.4節(jié)。GO、MGO的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

    表2 二羰基化合物多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)采集參數(shù)Table 2 MRM mass spectrometric acquisition parameters for determination of α-dicarbonyl compounds

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用GraphPad Prism 8.2.1軟件作圖,采用Rv3.5.0及RStudio v1.1.453軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 AGEs檢測(cè)方法建立

    UPLC-MS/MS因其具有靈敏度高和定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)被用于AGEs的檢測(cè)。Hull等使用UPLC-MS/MS建立食品中CML含量的檢測(cè)方法;Scheijen等使用UPLC-MS/MS建立同時(shí)檢測(cè)CML、CEL以及MG-H1含量的方法。然而,現(xiàn)有方法存在離子對(duì)試劑使用、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。本研究比較3 種色譜柱對(duì)AGEs的分離效果,發(fā)現(xiàn)ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)對(duì)CML、CEL、MG-H1具有良好的保留及分離效果,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)乙腈-水溶液(水相中含0.25 mol/L乙酸銨和1%甲酸)對(duì)3 種AGEs分離效果最佳,該條件下CML、CEL、MG-H1保留時(shí)間分別為8.30、7.96、6.53 min(圖1)。在10~200 ng/mL范圍內(nèi),CML、CEL、MG-H1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好(=0.999),檢出限低至2 ng/mL,定量限小于10 ng/mL(表3),精密度為1.35%~3.10%,加標(biāo)回收率為80.13%~122.90%(表4)。因此,優(yōu)化后建立的分析方法符合AGEs分析要求。

    圖1 CML、CEL和MG-H1的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of Nε-carboxymethyllysine,Nε-carboxyethyllysine and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine

    表3 CML、CEL和MG-H1的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 3 Calibration curves,limits of detection and limits of quantification of Nε-carboxymethyllysine,Nε-carboxyethyllysine and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine

    表4 CML、CEL和MG-H1的精密度和回收率Table 4 Precision and recoveries for Nε-carboxymethyllysine,Nεcarboxyethyllysine and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine

    2.2 市售魚(yú)加工食品中AGEs含量

    應(yīng)用所建立的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法分析65 種市售魚(yú)加工食品的AGEs含量(以每100 g蛋白計(jì)),結(jié)果見(jiàn)圖2。魚(yú)加工食品的MG-H1含量為10.01~145.11 mg/100 g,CEL 含量為2.41~84.83 mg/100 g,CML 含量為1.93~35.31 mg/100 g。所有魚(yú)加工食品中MG-H1含量均高于CML和CEL含量,其中茄汁沙丁魚(yú)罐頭的MG-H1含量約為其CML含量的20 倍,烤獅子魚(yú)片的MG-H1含量為其CEL含量的11 倍。Scheijen等分析荷蘭當(dāng)?shù)厝庵破贰⑷橹破?、魚(yú)制品、水果、蔬菜等190 種食品中的AGEs含量時(shí)也發(fā)現(xiàn)MG-H1含量大于CML和CEL含量的趨勢(shì)。另外,罐頭類(lèi)魚(yú)加工食品中3 種AGEs含量均呈較高水平,CML、CEL、MG-H1平均含量分別為13.20、34.26、62.73 mg/100 g,且含量分布范圍較大,推測(cè)罐頭制品的較高AGEs含量與其采用相對(duì)劇烈的殺菌方式有關(guān)。干制類(lèi)魚(yú)加工食品中AGEs含量普遍較低,其CML、CEL、MG-H1平均含量分別為6.45、6.07、19.48 mg/100 g。

    圖2 魚(yú)加工食品的CML(A)、CEL(B)和MO-H1(C)含量分布箱形圖Fig.2 Box plots of contents of Nε-carboxymethyllysine (A),Nεcarboxyethyllysine (B) and Nδ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine (C) in fish products

    2.3 市售魚(yú)加工食品組分及二羰基化合物含量

    魚(yú)加工食品的蛋白、脂肪、總糖、水分等組分含量受原料、輔料添加及加工過(guò)程的影響。65 種市售魚(yú)加工食品的蛋白、脂肪、總糖、水分含量,如圖3所示。4 類(lèi)魚(yú)加工食品的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.68%~83.10%、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.68%~50.59%、總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.37%~43.13%(均以干質(zhì)量計(jì)),水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.30%~82.70%(以濕質(zhì)量計(jì))。油炸類(lèi)魚(yú)加工食品蛋白含量相對(duì)較少與油炸會(huì)增加魚(yú)加工食品的脂肪含量相關(guān),烘烤類(lèi)及油炸類(lèi)魚(yú)加工食品在加工過(guò)程中通常需要添加糖類(lèi)以促進(jìn)魚(yú)加工食品的顏色及風(fēng)味物質(zhì)形成,因此其具有較高的總糖含量。與其他3 類(lèi)魚(yú)加工食品相比,罐頭類(lèi)魚(yú)加工食品加工方式及輔料添加較為復(fù)雜,導(dǎo)致其脂肪、水分含量范圍較大(脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.54%~50.59%,水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.30%~82.70%)。

    圖3 魚(yú)加工食品的蛋白(A)、脂肪(B)、總糖(C)和水分(D)含量分布箱形圖Fig.3 Box plots of contents of proteins (A),lipids (B),total sugars (C) and moisture (D) in fish products

    GO、MGO等二羰基化合物是形成AGEs重要前體物質(zhì)。65 種魚(yú)加工食品的GO、MGO含量(以每千克蛋白計(jì))如圖4所示。GO含量為0.02~22.56 mg/kg,紅杉魚(yú)干、紅娘魚(yú)干、油炸鰻魚(yú)絲、香辣銀魚(yú)、蒲燒秋刀魚(yú)具有較高GO含量(大于10 mg/kg);MGO含量為0.02~12.19 mg/kg,茄汁沙丁魚(yú)與紅燒金槍魚(yú)具有較高M(jìn)GO含量(大于10 mg/kg)。4 類(lèi)魚(yú)加工食品中,油炸類(lèi)魚(yú)加工食品GO平均含量最高(7.43 mg/kg),油炸類(lèi)、罐頭類(lèi)魚(yú)加工食品MGO平均含量較高,烘烤類(lèi)魚(yú)加工食品GO、MGO平均含量均最低。魚(yú)加工食品在加工過(guò)程中,其自身成分通過(guò)糖降解等途徑產(chǎn)生GO、MGO,同時(shí)調(diào)味品的添加也會(huì)引入GO、MGO。此外,罐頭類(lèi)魚(yú)加工食品的GO、MGO含量還與殺菌工藝有關(guān),Zhu Zongshuai等發(fā)現(xiàn)雞肉經(jīng)殺菌處理后GO含量增加,MGO含量降低。油炸類(lèi)魚(yú)加工食品中GO含量與烘烤類(lèi)、罐頭類(lèi)魚(yú)加工食品中GO含量存在顯著差異(<0.05)。

    圖4 魚(yú)加工食品的GO(A)和MGO(B)含量分布箱形圖Fig.4 Box plots of contents of glyoxal (A) and methylglyoxal (B) in fish products

    2.4 PCA及相關(guān)性分析

    如圖5A所示,PCA發(fā)現(xiàn),罐頭類(lèi)魚(yú)加工食品中AGEs呈較高水平。Scheijen等應(yīng)用UPLC-MS/MS分析190 種食品中CML、CEL、MG-H1水平發(fā)現(xiàn)罐頭食品含有較高的AGEs。如圖5B所示,魚(yú)加工食品中3 種AGEs含量與脂肪含量呈顯著正相關(guān),這可能與魚(yú)加工食品中脂肪氧化產(chǎn)生豐富的AGEs前體物質(zhì)-二羰基化合物有關(guān)。CML與CEL(=0.69,<0.001)、MG-H1含量(=0.54,<0.001)呈顯著正相關(guān),CEL與MG-H1含量呈顯著正相關(guān)(=0.81,<0.001);Michael、Sun Xiaohua等認(rèn)為,3 種AGEs形成可能存在相同途徑。CML、CEL、MG-H1含量與蛋白含量呈負(fù)相關(guān),CML、CEL與總糖含量不相關(guān),CML、CEL、MG-H1含量與GO、MGO等二羰基化合物含量不相關(guān)。劉慧琳等發(fā)現(xiàn),牛血清蛋白-葡萄糖模擬體系中CML含量與蛋白、葡萄糖濃度之間均呈正相關(guān),這可能是由于模擬體系的糖含量遠(yuǎn)高于食品體系,因此模擬體系中AGEs生成量隨蛋白含量的增加而增加,食品體系糖含量的不確定性導(dǎo)致其中AGEs含量與蛋白含量之間呈明顯的相關(guān)性,這需要進(jìn)一步深入研究。

    圖5 魚(yú)加工食品中所有指標(biāo)的PCA(A)及相關(guān)性分析(B)Fig.5 PCA plot (A) and correlation heat map (B) of all tested indicators in fish products evaluated together

    為比較各指標(biāo)在不同種類(lèi)魚(yú)加工食品中的相關(guān)性,分別對(duì)烘烤類(lèi)、油炸類(lèi)、罐頭類(lèi)、干制類(lèi)等4 類(lèi)魚(yú)加工食品的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行PCA(圖6)發(fā)現(xiàn),烘烤類(lèi)魚(yú)加工食品中CML-含量與脂肪含量呈正相關(guān),MG-H1含量與MGO含量呈正相關(guān)。干制類(lèi)魚(yú)加工食品中MG-H1含量與MGO含量同樣呈正相關(guān),這是由于MGO為MG-H1前體物質(zhì)。油炸類(lèi)魚(yú)加工食品中GO含量與總糖含量呈正相關(guān),CML、CEL含量與蛋白含量呈正相關(guān)。干制類(lèi)魚(yú)加工食品中CML、CEL含量與蛋白含量也呈正相關(guān),這可能是由于蛋白含量越高,可被糖基化修飾的賴(lài)氨酸等殘基也相應(yīng)增多,導(dǎo)致其產(chǎn)生較高的AGEs含量。罐頭類(lèi)、干制類(lèi)魚(yú)加工食品中CML、CEL含量與水分含量呈顯著負(fù)相關(guān),水分通過(guò)減少油脂與蛋白的接觸影響美拉德反應(yīng)進(jìn)程,導(dǎo)致AGEs含量隨水分含量的降低而上升。

    圖6 魚(yú)加工食品中所有指標(biāo)的PCAFig.6 PCA plots of all tested indicators in fish processing foods evaluated separately

    3 結(jié)論

    建立檢測(cè)魚(yú)加工食品中CML、CEL和MG-H1三種AGEs的UPLC-MS/MS方法;使用該方法分析65 種市售魚(yú)加工食品的AGEs含量,發(fā)現(xiàn)魚(yú)加工食品中MG-H1含量遠(yuǎn)高于CEL和CML;罐頭類(lèi)魚(yú)加工食品中AGEs含量呈較高水平,而干制品中3 種AGEs的含量相對(duì)較低。魚(yú)加工食品中3 種AGEs含量之間呈顯著正相關(guān);其AGEs含量與脂肪含量呈顯著正相關(guān),與蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān);烘烤類(lèi)、干制類(lèi)魚(yú)加工食品中MG-H1含量與MGO含量呈正相關(guān)。本研究為探究魚(yú)加工食品AGEs含量檢測(cè)與限量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供理論基礎(chǔ),對(duì)提升魚(yú)加工食品安全水平具有重要意義。

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