抗氧化酶和植物螯合肽對苧麻重金屬Cd脅迫的應答

全芮萍　陳建?！埨佟≡S明志　楊瑞芳　佘瑋　崔國賢

摘 ?要：為了探究抗氧化酶和植物螯合肽在苧麻耐鎘生理機制中的作用，本研究以苧麻耐性品種‘川苧8號為實驗材料，對其進行5、25、50 mg/L的鎘處理，7 d后分別測定其生物量、鎘含量、抗氧化酶活性、植物螯合肽含量以及相關基因表達量。結果表明5 mg/L鎘處理‘川苧8號的株高、根長與生物量受到促進，25、50 mg/L鎘處理下‘川苧8號的株高、根長與生物量受到抑制，‘川苧8號主要將鎘積累在根部，不同鎘處理下轉運系數(shù)均小于1，25 mg/L鎘處理時鎘積累量與轉運系數(shù)均顯著高于其他處理;鎘脅迫后‘川苧8號地上部和地下部超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著升高，丙二醛（MAD）活性顯著降低，過氧化氫（H₂O₂）含量顯著上升;5、25 mg/L鎘處理時地下部植物螯合肽（PCs）與谷胱甘肽（GSH）含量顯著低于對照，50 mg/L鎘處理時高于對照但未達到顯著差異;PCs和GSH在地上部和地下部承擔著不同的解毒作用;各濃度處理的地上部BnPCS1相對表達量均與鎘含量呈極顯著正相關（P<0.01），高濃度（25、50 mg/L）處理的地上部BnGCL1相對表達量與鎘含量呈正相關（P<0.01）;低濃度（5?mg/L）處理下SOD活性顯著高于對照，與各部位鎘含量均呈極顯著正相關（P<0.01），高濃度鎘處理時地下部SOD活性與鎘含量呈極顯著負相關（P<0.01），地下部PCs含量與鎘含量呈極顯著正相關（P<0.01）。綜合分析說明，‘川苧8號在低濃度鎘脅迫時主要通過激活抗氧化酶活性消除細胞中自由基的毒害，高濃度鎘脅迫時通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和PCs與GSH合成解除鎘的毒害。

關鍵詞：苧麻;鎘;抗氧化酶;植物螯合肽中圖分類號：S563.1??????文獻標識碼：A

Responses of Ramie to Antioxidant Enzymes and Plant Chelating Peptides to Cd Stress

Abstract： In order to explore the role of antioxidant enzymes and plant chelating peptides in the physiological mechanism of ramie tolerance to cadmium， Cd-tolerant ramie variety ‘Chuanzhu 8 was treated with 5， 25， 50 mg/L cadmium， and the biomass， cadmium content， antioxidant enzyme activity， plant chelating peptide content and related gene expression were assayed seven days later. The plant height， root length and biomass treated with 5 mg/L cadmium were promoted， and the plant height， root length and biomass treated with 25， 50 mg/L cadmium were affected. Cadmium was mainly accumulated in the root， the transport coefficient under different cadmium treatment was ?less than one， and the cadmium accumulation and transport coefficients under 25 mg/L cadmium was significantly higher than that of other treatments. The superoxide dismutase （SOD） activity significantly increased， the， malondialdehyde （MAD） activity significantly decreased in cadmium stress. The hydrogen peroxide （H₂O₂） content significantly increased， the underground plant chelating peptides （PCs） and glutathione （GSH） content was significantly lower than that of the control under 5?mg/L and 25 mg/L cadmium treatments， and was higher than that of the control under 50 mg/L cadmium， but did not reach a significant difference. PCs and GSH had different detoxification effects in aboveground and underground parts. The relative expression of abovegroundBnPCS1 and cadmium content under various concentration treatments were extremely significantly positively correlated （P<0.01）， and the relative expression of abovegroundBnGCL1at a high concentration （25 mg/L and 50 mg/L） was positively correlated with cadmium content （P<0.01）. SOD activity under low concentration （5 mg/L） was significantly higher than that of the control， and had the same cadmium content in all parts. There was a very significant positive correlation （P<0.01）. The SOD activity and cadmium content in the underground was extremely significantly negatively correlated （P<0.01） when treated with high concentration of cadmium， and the PCs content and the cadmium content in the underground were extremely significantly positively correlated （P<0.01）. Comprehensive analysis showed that ‘Chuanzhu 8 mainly used antioxidant enzyme activity to eliminate the toxicity of free radicals in cells under low concentration cadmium stress. Under high concentration cadmium stress， it relieved cadmium by regulating antioxidant enzyme activity and the synthesis of PCs and GSH.08CF8F0D-7EAF-4B64-B23F-6B8E29A5D950

Keywords： ramie; cadmium; antioxidant enzymes; plant chelating peptides

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.017

鎘（Cd）是一種對動植物具有劇毒，且毒性持久的非必需元素，嚴重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量^[1]。鎘進入植物體后，會替換其他離子吸收轉運相關的結合位點，導致新陳代謝紊亂，影響細胞結構^[2-3]，當土壤受到鎘污染后，鎘會在生物體內(nèi)富集，并通過食物鏈進入人體從而引起慢性中毒^[4]。生態(tài)環(huán)境部2020年5月7日公布的《2019年全國生態(tài)環(huán)境質(zhì)量簡況》中指出，影響農(nóng)用地土壤環(huán)境質(zhì)量的主要污染物是重金屬，其中鎘為首要污染物。

植物經(jīng)過長期進化演變，進化出了一套復雜的耐鎘機制，主要包括細胞壁、抗氧化系統(tǒng)、螯合蛋白、轉運蛋白等協(xié)同作用，消除由鎘引發(fā)的O₂^–·、H₂O₂過量積累導致的膜脂過氧化反應和細胞膜損壞^[5]。當植物面對氧化脅迫時可啟動由超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶組成的自身保護系統(tǒng)，提高清除活性氧自由基（ROS）的能力，其中SOD作為抵抗ROS的第一道防線^[6-7]，可快速將O₂^–·轉化為H₂O₂^[8-9]，降低過氧化傷害，提高植物耐鎘性。非巰基蛋白如植物螯合肽（phytochelatin， PCs）等能直接螯合重金屬離子參與解毒。PCs是由植物螯合肽合酶（phytochelatin synthase， PCS）催化，以還原型谷胱甘肽（glutathione， GSH）為底物合成^[10]，PCs中半胱氨酸的巰基（-SH）結合Cd²⁺形成Cd-PC復合物，并通過液泡膜上的轉運蛋白-ABC運輸體將其轉運至液泡內(nèi)完成對鎘的解毒作用^[11-13]。

苧麻（Boehmeria nivea）屬蕁麻科苧麻屬，生長迅速、根系龐大、生物產(chǎn)量高。已有研究證明其對鎘、鉛、銅等多種重金屬具有較好的耐性和積累能力^[14-16]，是我國南方重金屬污染農(nóng)田替代種植作物。本研究通過盆栽試驗，研究鎘對苧麻的生長、鎘含量、抗氧化酶與植物螯合肽的影響，從生理和分子層面研究鎘脅迫下苧麻耐鎘機制。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試品種為耐鎘品種‘川苧8號，生化試劑OmniPlant RNA Kit（DNase I）購自康為世紀（北京）生物科技有限公司，EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Green qPCR SuperMix購自全式金（北京）生物技術有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫（H₂O₂）試劑盒購自索萊寶（北京）生物科技有限公司，谷胱甘肽（GSH）、非蛋白巰基（NPT）購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 ?試驗設計??盆栽試驗于2021年3—7月在湖南農(nóng)業(yè)大學苧麻智能溫室進行。于苧麻種質(zhì)資源圃剪取嫩梢，扦插育苗，麻苗均高25～30 cm時，選取高度、長勢一致的健康苗定植于以膨脹珍珠巖基質(zhì)的聚乙烯塑料盆中。每周添加一次1/2 Hoagland全面營養(yǎng)液。培育3周后，在苧麻盆栽中添加鎘溶液500 mL。Cd²⁺供體為鎘標準溶液，試驗設置0、5、25、50 mg/L 4個Cd²⁺濃度水平，以不加鎘標準液為對照，每個處理重復3次。

1.2.2 ?測定項目??（1）生物量與鎘含量測定。鎘處理1周后小心取出整株苧麻，用去離子水洗凈塵土與珍珠巖，吸水紙擦干水分，稱重記錄，一部分經(jīng)105℃殺青30 min，然后65℃烘干至恒重，研磨、過篩，樣品采用HNO₃-HClO₄法消化。采用SOLAAR M6型原子吸收光譜儀測定重金屬鎘含量。另一部分按地下部、地上部分別用液氮速凍，于–80℃保存，備用。

（2）生理指標測定。超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、過氧化氫（H₂O₂）含量采用北京索萊寶生物科技有限公司試劑盒測定，谷胱甘肽（GSH）、非蛋白巰基（NPT）含量采用南京建成生物工程研究所相應的試劑盒測定。植物螯合肽（PCs）含量=非蛋白巰基（NPT）含量-谷胱甘肽（GSH）含量。

（3）BnPCS1與BnGCL1表達分析。苧麻植物螯合肽合成酶基因（BnPCS1）和半胱氨酸連接酶基因（BnGCL1）的引物序列根據(jù)苧麻基因組（PHNS00000000.1）中的PCS1和GCL1基因序列設計。引物由擎科生物有限責任公司合成，引物序列見表1。

各處理分別取1 g苧麻組織，提取總RNA，反轉錄成cDNA作為模板，進行實時熒光定量PCR擴增檢測基因的表達量。反應體系為：2×SYBR Green PCR Mix 10 ?L、QF（10 μmol/L）0.5 μL、QR（10 μmol/L）0.5 μL、cDNA 2 ?L和ddH₂O 7 ?L。反應條件為：94℃（30 s）;94℃（5?s）、61℃（35?s）45個循環(huán)。每個樣本重復3次。以苧麻肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參。采用2^-??CT法計算基因的相對表達量。08CF8F0D-7EAF-4B64-B23F-6B8E29A5D950

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0和Origin 2019軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與作圖。采用LSD法分析差異顯著性。F檢驗P≤0.05時為顯著差異。

植株地上部重金屬累積量=植株地上部重金屬含量×植株地上部生物量;植株地下部重金屬累積量=植株地下部重金屬含量×植株地下部生物量。轉運系數(shù)=植株地上部鎘含量（mg/kg）/植株地下部鎘含量（mg/kg）。

2??結果與分析

2.1鎘脅迫對苧麻生長的影響

鎘處理顯著影響苧麻的生長發(fā)育（圖1A），5?mg/L處理促進苧麻根的生長，較對照顯著上升44.88%，而25 mg/L和50?mg/L處理較對照顯著下降了18.81%和35.43%（圖1B）。5?mg/L處理促進苧麻生長發(fā)育，地上部比對照上升3.02%，而25?mg/L和50?mg/L處理較對照顯著下降45.97%和72.71%;地下部在5?mg/L處理下較對照上升26.43%，25 mg/L和50 mg/L處理較對照顯著下降25.19%和70.36%，在5 mg/L處理下苧麻地下部鮮質(zhì)量的增長幅度大于地上部（圖1C）。

2.2 ?鎘脅迫對苧麻鎘含量、鎘積累量和轉運系數(shù)的影響

隨著鎘處理濃度的上升，苧麻地上部與地下部鎘含量顯著上升，50?mg/L鎘處理的地上部與地下部鎘含量達到最高，分別為38.79 mg/kg和69.04 mg/kg，且各處理下地下部含量均高于地上部。25 mg/L和50 mg/L鎘處理的地上部鎘含量較5?mg/L處理顯著上升126.82%和204.24%，地下部鎘含量與5 mg/L處理相比顯著上升了99.55%和213.96%（圖2A）。在25 mg/L處理下‘川苧8號植株內(nèi)鎘積累量達到最高，且顯著高于其他處理，5、25、50 mg/L鎘處理的每株地上部鎘積累量分別為48.69、57.93、39.24 μg，每株地下部積累量分別為68.71、81.13、50.57 μg（圖2B）。各個處理的轉運系數(shù)均小于1（圖2C）。

2.3 ?鎘脅迫對苧麻氧化脅迫和抗氧化酶活性的影響

丙二醛（MDA）作為植物細胞脂質(zhì)過氧化的

最終產(chǎn)物，可作為植物氧化脅迫程度的指標^[17]。5、25、50 mg/L鎘脅迫下‘川苧8號地上部的MDA含量分別較對照顯著下降了14.23%、10.31%和57.31%，5 mg/L鎘處理時地下部MDA含量達到最高，較對照顯著上升13.99%，后隨處理濃度的上升較對照分別降低5.20%和36.69%;50 mg/L鎘處理的地上部與地下部MDA含量均為最小值（圖3A）。50 mg/L鎘處理的地上部H₂O₂含量達到最高且顯著高于其他水平，較對照顯著上升30.47%;而25 mg/L鎘處理的地下部H₂O₂含量顯著高于其他處理，較對照顯著上升34.56%，50 mg/L處理的含量最低，較對照顯著下降24.13%，各個處理的地下部H₂O₂含量顯著高于地上部（圖3B）。鎘脅迫后地上部與地下部超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著增加，5、25、50 mg/L鎘處理下地上部SOD活性較對照分別增加了89.34%、14.75%和113.08%，地下部SOD活性較對照分別增加了320.82%、90.30%和

2.4 ?鎘脅迫對苧麻植物螯合肽（PCs）和谷胱甘肽（GSH）含量的影響

5 mg/L鎘處理時‘川苧8號地上部PCs含量較對照下降10.05%，25 mg/L和50 mg/L鎘處理較對照分別增加了5.08%和2.06%;5、25、50?mg/L鎘處理下地下部PCs含量分別較對照下降了22.25%、13.12%和0.57%（圖4A）。5 mg/L鎘處理時地上部GSH含量較對照顯著增加16.08%，25 mg/L和50 mg/L鎘處理時分別較對照下降12.69%和42.71%;在5 mg/L和25 mg/L處理時地下部GSH含量分別較對照顯著下降12.39 %和27.75%（圖4B）?！ㄆr8號地上部PCs和GSH含量均顯著高于地下部，植株PCs含量顯著高于GSH含量。

2.5鎘脅迫對BnPCS1和BnGCL1的相對表達量的影響

植物螯合肽合酶（PCS）是控制植物螯合肽（PCs）合成的關鍵酶。5 mg/L鎘處理時‘川苧8號地上部的BnPCS1相對表達量達到最高，較對照顯著增加了30.47%，25 mg/L鎘處理時最低，較對照顯著降低了37.59%;地下部的BnPCS1相對表達量隨鎘濃度的增加顯著下降，5、25、50 mg/L各處理的表達量分別較對照下降了35.05%、60.95%和71.19%（圖5A），各處理的地下部BnPCS1相對表達量均高于地上部。γ-谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）是谷胱甘肽（GSH）合成途徑的限速酶，GCL通常決定細胞GSH水平和GSH的生物合成能力。，5、25、50 mg/L鎘處理下‘川苧8號地上部的BnGCL1相對表達量分別較對照減少了53.50%、20.63%和5.79%，地下部的BnGCL1表達量分別較對照減少了56.23%、62.47%和68.14%（圖5B）。08CF8F0D-7EAF-4B64-B23F-6B8E29A5D950

2.6 鎘脅迫下鎘含量與生理指標及相關基因表達量的相關性分析

低濃度（5 mg/L）處理的地上部、地下部SOD活性均與鎘含量呈極顯著正相關（P<0.01）;高濃度（25 mg/L和50 mg/L）下，地上部SOD活性與鎘含量呈極顯著正相關（P<0.01），地下部SOD活性與鎘含量呈極顯著負相關（P<0.01）。H₂O₂與鎘含量的相關性和SOD活性一致。各個濃度處理下地上部BnPCS1的相對表達量均與鎘含量呈極顯著正相關（P<0.01），地下部的BnPCS1相對表達量與鎘含量呈顯著負相關（P<0.01）;在高濃度下地上部的BnGCL1相對表達量與鎘含量呈正相關（P<0.01）（圖6）。

3 ?討論

鎘作為植物非必需金屬元素，當植物組織鎘含量超過5～10 μg/g時，對植物造成毒害作用，影響植株的生長^[18]，其具體表現(xiàn)為植株矮小、生物量減少等^[19-20]。本研究中，5 mg/L鎘處理提高了苧麻的株高、根長與生物量，25 mg/L和50 mg/L鎘處理下苧麻株高、根長與生物量顯著降低，但葉片始終保持綠色?！ㄆr8號地下部與地上部鎘含量隨鎘濃度的上升逐漸增加，且地下部鎘含

量始終高于地上部鎘含量，各濃度處理下轉運系數(shù)均小于1，這與獼猴桃^[21]、葡萄^[22]、山定子^[23]的分布規(guī)律一致，表明‘川苧8號主要通過根部積累鎘，根對鎘有較強的滯留作用，可限制鎘從根系向地上部遷移，減少對地上部光合系統(tǒng)的損傷。

植物在正常條件下能夠有效地清除體內(nèi)的活性氧自由基（ROS）使細胞免受傷害，但在重金屬鎘毒害脅迫下，植物體內(nèi)的ROS產(chǎn)生速度超過植物清除ROS的速度，造成ROS在細胞中積累^[24]，產(chǎn)生丙二醛（MDA）等產(chǎn)物并造成DNA和蛋白質(zhì)損傷以及細胞脂質(zhì)過氧化^[25]。在本研究中，除地下部MDA活性在5 mg/L處理時出現(xiàn)小幅上升外，其余均低于對照，說明‘川苧8號在鎘脅迫下受到的氧化傷害較小，細胞膜的穩(wěn)定性和功能的完整性沒有受到較大損害。本研究中，鎘處理下‘川苧8號體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性均高于對照，低濃度（5 mg/L）處理下SOD活性與鎘含量在地上部、地下部位均呈極顯著正相關（P<0.01），高濃度下（25 mg/L和50 mg/L），地上部SOD活性與鎘含量呈極顯著正相關（P<0.01），地下部SOD活性與鎘含量呈極顯著負相關（P<0.01）。低濃度鎘處理時‘川苧8號

通過提高體內(nèi)SOD活性將有害的O₂^–·轉化為H₂O₂和O₂，能有效清除過量的活性氧，以保持細胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的平衡，減輕脂質(zhì)過氧化程度與過氧化脅迫，這也從側面解釋了‘川苧8號體內(nèi)H₂O₂含量上升的原因。高濃度鎘處理時地下部SOD活性降低，但是植物氧化脅迫程度的指標MDA含量并沒有增加，說明除了抗氧化酶，‘川苧8號存在其他的解毒途徑防止植株遭受氧化傷害。

除抗氧化酶外，植物應對重金屬脅迫的另一個策略是在細胞內(nèi)合成巰基化合物（GSH和PCs等多肽物質(zhì)）螯合重金屬，減輕游離重金屬離子對細胞的毒害。PCs是一類結構特殊的金屬巰蛋白，是以GSH為底物的生物合成的酶促產(chǎn)物。GSH作為PCs的前體，由γ-谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）和谷胱甘肽合成酶（GS）通過ATP催化合成，合成過程中由多種因素調(diào)節(jié)，主要以GCL的調(diào)節(jié)為主^[26]。孫琴等^[27]研究發(fā)現(xiàn)小麥根系GSH含量隨Cd濃度的增加而上升。ZHAO等^[28]發(fā)現(xiàn)Pb脅迫下礦區(qū)生態(tài)型華中蓋蹄蕨根和葉中的GSH含量均顯著升高。同時有研究認為，GSH和PCs在植物不同部位承擔著重金屬解毒功能，PCs主要在根部，而GSH則在葉片的解毒上有更顯著的作用^[29]。另外，近年來研究發(fā)現(xiàn)植物根系通過減少植株PCs的合成來減少鎘向地上部的運輸，從而降低鎘對葉片等器官的毒害，增強作物耐鎘性能^[30]。本研究中，5 mg/L鎘處理的地上部和地下部PCs含量下降，50?mg/L鎘處理時升高，與李雪玲^[31]的研究結果相似，說明高濃度下進入細胞的大量Cd激活了PCs合成酶，進而促進了PCs的合成，也導致底物GSH含量持續(xù)減少。

鎘處理下剛毛檉柳^[32]葉片ThPCS1基因與苜蓿^[33]根和莖尖MsPCS1基因表達下調(diào)，推測可能與PCS在植株不同部位發(fā)揮耐鎘作用有關。本研究中，5 mg/L鎘處理的地上部BnPCS1基因上調(diào)表達，其余處理的相對表達量均下調(diào)，在各個濃度處理的地上部BnPCS1基因相對表達量均與鎘含量呈極顯著正相關（P<0.01），地下部BnPCS1相對表達量與鎘含量呈極顯著負相關（P<0.01），進一步說明PCs在地上部和地下部承擔著不同的解毒作用;高濃度鎘處理的地上部BnGCL1相對表達量與鎘含量呈極顯著正相關（P<0.01），地下部BnGCL1相對表達量與鎘含量呈極顯著負相關（P<0.01），說明GSH在地上部和地下部的解毒作用也不相同。綜合分析得出，‘川苧8號在低濃度鎘脅迫時主要通過激活抗氧化酶活性消除細胞中自由基的毒害，高濃度鎘脅迫時通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和PCs與GSH合成解除鎘的毒害。08CF8F0D-7EAF-4B64-B23F-6B8E29A5D950

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